1 Introduction

The clonal selection theory by F.M. Burnet (1957), proposes that one mature B lymphocyte expresses one immunoglobulin receptor of one specificity, prior to any antigenic stimulation. Diversity of the immunoglobulin (Ig) repertoire is then accomplished by the total cells of the immune system. Consequently, B cells that display hostile specificities against self-antigens are eliminated during ontogeny. The theory became a central dogma in immunology. Soon after its releases many experimental protocols were designed to analyse the specificity of antibodies produced by a single B cell. The finding of one-lymphocyte–one antibody was reported in many instances in agreement with Burnet hypothesis. However cells secreting two antibody molecules of different specificities (double cells) were repeatedly observed. Moreover, recent findings obtained in a transgenic model of autoimmunity confirm the existence of ‘double B cells’, a feature that allows autoimmune B cells to escape negative selection during ontogeny.

2 Kinetics of double producers

3 Antigen-driven intraclonal variation of normal B lymphocytes

4 Multiple rearrangements, receptor editing and ‘double producers’

5 Conclusion

La théorie de sélection clonale de M.F. Burnet, publiée en 1957 [1] propose qu'un lymphocyte issu de la moelle osseuse, le lymphocyte B, exprime à sa membrane, avant tout contact avec l'antigène, un type de récepteur immunoglobulinique (Ig) et un seul, d'une seule spécificité. La liaison du récepteur avec l'antigène (Ag) déclenche ensuite la prolifération du clone B, de spécificité correspondante, et sa différenciation en cellules productrices d'anticorps. C'est l'ensemble des lymphocytes B du système immunitaire qui rend compte de la diversité du répertoire des Ig capables de reconnaître les déterminants antigéniques (épitopes) présents dans la nature. Un des points importants de la théorie concerne la tolérance immunitaire, c'est-à-dire la faculté naturelle d'un organisme à ne pas déclencher de réponse immune contre ses propres épitopes. Selon Burnet, les lymphocytes auto réactifs délétères passent par une phase de différenciation qui les expose aux auto-antigènes avec pour conséquence une délétion clonale. Cette étape appelée depuis, étape de sélection négative se produit chez l'embryon avant que le système immunitaire ne puisse développer une réponse contre les antigènes hétérologues. La théorie clonale est devenue, depuis plus de cinquante ans, un des dogmes centraux en immunologie. Très tôt, des preuves expérimentales l'ont étayée, mais très tôt également des travaux montraient qu'un nombre substantiel de lymphocytes B y échappaient et synthétisaient deux types d'anticorps de deux spécificités différentes [2]. Ces résultats étaient considérés au mieux comme marginaux donc négligeables ou bien artéfactuels. Les travaux récents de Gerdes et Wabl [3] dans un modèle de souris transgéniques confirment l'existence des « doubles producteurs ». Ces « doubles » permettent l'échappement de certains lymphocytes B auto-immuns à la sélection négative et apportent vraisemblablement des éléments nouveaux à la compréhension des pathologies auto-immunes.

Dès la mise au point des premières techniques de visualisation des anticorps au niveau cellulaire, des recherches furent entreprises pour vérifier la théorie de sélection clonale. En 1958, Coons [4] immunisait des lapins avec les protéines HGG et OVA et observait en immunofluorescence, méthode qu'il venait de mettre au point, les lymphocytes fixant à leur membrane les Ag (HGG et OVA) marqués respectivement à la rhodamine et à la fluorescéine. Simultanément, Nossal [5], après avoir immunisé des rats avec des extraits de flagelline provenant de deux souches de salmonelles ne présentant pas de réactions croisées (S. Adelaïde et S. Typhi), micromanipulait des lymphocytes B isolés, puis examinait l'immobilisation ou non des deux types bactériens vivants par les anticorps spécifiques secrétés par une seule cellule. Une méthode analogue en microgouttes permettait à Mäkelä et Nossal d'étudier la neutralisation de deux bactériophages T2 et T5 [5]. Avec la méthode des plages de lyse (PFC) mise au point par Jerne et Nordin [6], technique précurseur des Elispots, un grand pas était réalisé en immunologie cellulaire. Pour la première fois, un nombre important de cellules individuelles productrices d'anticorps étaient identifiées au microscope et comptées. Après immunisation des animaux avec des globules rouges (GR) hétérologues, la sécrétion d'anticorps par des lymphocytes isolés, spléniques ou ganglionnaires, était détectée dans un milieu gélifié comprenant du complément et un tapis d'érythrocytes immunisants. Une hémolyse locale (PFC) permettait la détection d'anticorps spécifiques anti-globules rouges de classe IgM, mais aussi de classe IgG, par une seule cellule B.

Ces techniques cellulaires pionnières, dont la liste n'est pas exhaustive, ont donné lieu à 21 publications rassemblées dans une revue publiée en 1970 par Mäkela et Cross [2]. Ces publications peuvent être regroupées en trois catégories : (1) une seule spécificité est produite par les cellules B, dirigée contre l'un ou l'autre des antigènes immunisants ; (2) un pourcentage faible de cellules doubles est détecté (0,5 à 1,5% par rapport à l'ensemble des cellules productrices d'anticorps spécifiques ; (3) un pourcentage de cellules bispécifiques, supérieur à 10%, est observé. Étant donné la disparité de ces résultats, la question des doubles restait entière. La présence possible de réactions croisées était l'argument majeur avancé par les détracteurs des résultats positifs sur les « doubles ». En effet, des déterminants communs entre le couple de protéines, de bactéries, de phages ou de GR étaient souvent recherchés au niveau sérologique avec des méthodes peu sensibles. Par conséquent, la sécrétion d'un type d'anticorps unique reconnaissant un épitope mineur, commun entre les deux Ag, ne pouvait être totalement écartée au niveau cellulaire.

La méthode des PFC, devenue très sensible grâce l'utilisation d'un milieu liquide au lieu du milieu gélifié [7], incita P. Liacopoulos et ses collaborateurs à reprendre la problématique des « doubles ». Une sensibilité élevée permettait en effet de détecter, non plus uniquement des plasmocytes, mais aussi les cellules B productrices d'anticorps en voie de différenciation. En effet, nous avions observé que la plupart des travaux antérieurs analysaient la réponse après hyper immunisation des animaux, quand la différenciation B en plasmocytes est accomplie. Concernant l'antigène GR, la réponse B primaire ou secondaire s'obtient quatre à cinq jours après l'injection en absence d'adjuvant. Nos études se sont donc surtout focalisées sur le début de la réponse « ex vivo » [8], mais aussi « in vitro » [9,10] entre les jours 2 et 6 après immunisation et toujours avec des doses d'antigènes non optimales, afin d'étudier un maximum de PFC formées d'immunoblastes en voie de différenciation. L'originalité de nos premières études consistait donc à décrire la cinétique de la réponse anticorps après immunisation de souris avec un mélange de globules rouges de mouton (GRM) et de globules rouges de pigeon (GRP), phénotypiquement distincts [11]. D'une façon constante, 2 à 3% de cellules « doubles productrices » étaient observées « ex vivo » au début de la réponse primaire ou de la réponse secondaire, et toujours d'une manière transitoire entre les jours 2 et 4 après immunisation. Dans des expériences de stimulation primaire « in vitro » avec les mêmes érythrocytes, un pourcentage analogue de « doubles producteurs » était détecté dans la phase précoce de la stimulation antigénique [9]. Ces pourcentages confirmaient ce que nous avions publié auparavant «  in vivo » avec la technique des rosettes, où nous observions au microscope l'adhérence simple ou double, sur les lymphocytes spléniques immuns, des GRM et des GRP [12]. Afin de résoudre le problème récurrent des déterminants communs entre les deux types érythrocytaires, nous avons immunisé les animaux, dans un premier temps, avec le trinitrophényl couplé aux GRP (TNP–GRP) [13], puis avec différents complexes haptène–protéines [14]. Comme précédemment, des lymphocytes B « doubles producteurs » anti-haptènes étaient présents pendant la phase précoce de la réponse immune. Les Ag étaient aussi différents que le TNP conjugué à l'hémocyanine : TNP–KLH, la p-amino-phenyl-β-d-lactoside (Lac) couplés à la KLH : Lac–KLH, ou l'acide sulfanilique (SULF) couplé au lysozyme de poulet (SULF–LZ). Les PFC étaient alors détectées sur un mélange de GRM et GRP conjugués, chacun avec un des deux haptènes immunisants : TNP–GRM et SULF–GRP, par exemple. À nouveau, 3% environ de PFC « doubles » anti-haptènes étaient identifiées « ex vivo » au début de la réponse secondaire dans la rate des souris immunisées. Nous pouvions alors avancer dans l'interprétation des plages « doubles ». Trois hypothèses étaient envisageables : (1) deux types d'anticorps étaient synthétisés par une même cellule ; (2) un seul anticorps était produit, reconnaissant des déterminants communs (réactions croisées) entre les deux composés hapténiques ; (3) les PFC doubles synthétisaient un type d'immunoglobuline avec un site anticorps polyfonctionnel, capable de reconnaître deux épitopes distincts [15]. La micromanipulation de PFC individuelles nous a permis de trancher entre ces trois hypothèses. Le principe était d'effectuer des inhibitions compétitives au niveau de PFC individuelles, en ajoutant dans le milieu de détection un ou les deux haptènes sous forme soluble. Les PFC doubles micromanipulées dans le milieu initial ont donc été transférées dans un second milieu contenant le même couple haptène–GR avec, en supplément, un des deux haptènes solubles, puis elles ont été transférées dans un troisième milieu identique au milieu initial (sans inhibiteur). La grande majorité des cellules bi-productrices qui restaient actives dans ces trois milieux successifs lysaient un seul type d'haptène–GR quand elles étaient transférés dans le second milieu, contenant l'haptène soluble alternatif. À nouveau, ces PFC lysaient simultanément les deux types de GR indicateurs quand elles étaient transférées dans le 3^e milieu, dépourvu d'inhibiteur soluble. Par conséquent, l'inhibition des anticorps secrétés par la « cellule double » n'était pas compétitive, car l'inhibition d'un anticorps n'interférait pas avec la lyse de l'autre type érythrocytaire portant l'haptène non apparenté.

Nous pouvions donc conclure que la double lyse n'était pas due à l'existence d'un déterminant commun entre les deux paires d'antigènes donc à des réactions croisées. D'autre part, ces tests permettaient d'exclure la synthèse d'un anticorps polyfonctionnel car, dans ce cas, l'inhibition avec l'haptène couplé à un carrier protéique (haptène polyvalent) inhibe les deux réactivités [16]. Par conséquent, l'absence d'une inhibition compétitive nous permettait de conclure que deux anticorps de spécificités différentes étaient produits par une même cellule B.

Une méthode permettant la micro-culture d'un seul lymphocyte B, développée par Cunningham et Fordham [17], nous a permis de suivre l'évolution clonale pendant 48 h d'une PFC provenant d'animaux doublement immunisés par deux haptènes. Lorsqu'une cellule « double » était mise en culture, sa descendance se divisait majoritairement en clones de l'une ou l'autre des spécificités immunisantes, montrant le caractère transitoire de la double spécificité. À notre grande surprise, si 50% des PFC monospécifiques ne généraient que des cellules filles de spécificité identique, 50% généraient aussi des PFC monospécifiques, mais de l'une ou l'autre spécificité, opérant ainsi une variation au cours de la division clonale (Fig. 1). Ce changement de spécificité était dépendant des antigènes, puisque l'absence d'un des deux antigènes pendant 48 h conduisait à une disparition du clone de spécificité correspondante. Dans cette série d'expériences, des inhibitions avec les haptènes solubles au niveau des PFC micromanipulées ont permis à nouveau de contrôler la spécificité des anticorps produits. Par la même technique, dans un travail en collaboration avec S. Avrameas, des cellules B individuelles, produisant des Ig, mais sans fonction anticorps détectable, provenant de souris immunisées par la peroxydase, généraient en culture des cellules filles anti-peroxydase an présence de l'antigène. Une variation intra clonale s'opérait donc à partir de B Ig non spécifiques vers des B Ig spécifiques, au niveau d'un même clone [18]. Les travaux de Cunnigham [17] par la même méthodologie montraient aussi que les cellules filles générées à partir d'une PFC provenant d'une souris immunisée avec un seul antigène présentaient aussi spontanément un degré de variation intra clonale de l'ordre de 2 à 5%. Dans nos travaux, la stimulation antigénique amplifiait cette dérive clonale antigène spécifique. Les lymphocytes B différentiés exprimaient donc deux types de récepteurs B (BCR) capables de répondre à une stimulation antigénique et de produire les anticorps de spécificité correspondante.

En général, un lymphocyte B n'exprime à sa membrane qu'un des deux allèles de la chaîne H et un des deux allèles de la chaîne L pour former le récepteur B. C'est le phénomène de l'exclusion allélique, établi par Pernis et al. au niveau cellulaire pour la chaîne H des Ig [19] après la découverte des marqueurs allotypiques [20]. Il s'agit d'un mécanisme peu fréquent dans les systèmes biologiques. L'exclusion allélique établie pour la chaîne L comme pour la chaîne H devenait alors la clé de voûte de la théorie de Burnet. Elle était affirmée, mais non formellement confirmée expérimentalement, par le travail de S. Tonegawa qui, en 1977, démontrait que les gènes des immunoglobulines sont produits par recombinaison somatique durant l'ontogenèse B [21]. Les gènes V (variables) D (diversité) J (gènes jonctionnels) et C (gène de la partie constante) de la chaîne H sont distants de plusieurs centaines de kilobases sur le même chromosome. Ils deviennent jointifs au stade pré-B, avec délétion de matériel génomique. La chaîne L va subir le même type de réarrangement (sans gène D) et les deux chaînes H et L après transcription vont être traduites et s'exprimer à la membrane pour former le BCR. L'exclusion allélique n'est pas inscrite dans ce processus, mais les réarrangements s'opèrant en cis pour une chaîne donnée la renforçaient. Plusieurs modèles étaient proposés pour interpréter l'exclusion allélique nécessaire : (1) le modèle stochastique postulant qu'une telle recombinaison VDJ puis VJ ne pouvait être que rare pour un lymphocyte B et donc qu'un second réarrangement était improbable [22] ; (2) le modèle régulateur proposant qu'une fois le réarrangement effectué, un processus d'inhibition d'un second réarrangement productif était bloqué [23] ; (3) la machinerie enzymatique RAG, qui gouverne les réarrangements, serait épuisée par une première recombinaison et deviendrait donc indisponible pour un second réarrangement.

Cependant, dans notre laboratoire, l'analyse d'un myélome humain par immunofluorescence montrait qu'un clone unique était producteur de deux immunoglobulines : une IgG1κ et d'une IgGlλ [24], montrant qu'une inclusion isotypique de la chaîne L conduisait à la synthèse simultanée de deux IgG, la spécificité anticorps n'ayant pu être caractérisée. Et, dès 1982, les travaux de Lewis et Baltimore démontraient que des réarrangements productifs en cis de la chaîne légère κ pouvaient se produire au cours des divisions clonales d'une lignée pré-B transformé par un virus murin (AmuLV) [25], alors que le groupe de Rajewsky décrivait un hybridome producteur d'IgD ayant généré des variants idiotypiques au niveau de la chaîne lourde, par recombinaison VDJ subséquente [26]. Wabl dans une lignée murine pré-B décrivait la production simultanée de deux chaînes H par inclusion allélique [27]. Dans l'analyse de A. Caton, des sous-clones d'hybridomes provenant initialement d'une même cellule pré-B présentaient des réarrangements V–J différents de la chaîne légère L. Plus intéressant, ces clones produisaient des anticorps spécifiques anti-influenza (HA) contre des épitopes B différents [28]. De même, l'examen de plusieurs lignées tumorales B montrait que le réarrangement primaire de la chaîne κ était remplacé par un second réarrangement Vκ–Jκ au cours de la division clonale [29]. Il était déjà évident qu'un réarrangement au niveau de chaîne L mais aussi de la chaîne H n'oblitérait pas de seconds réarrangements productifs. Il s'agit de quelques exemples à partir de lignées transformées ou d'hybridomes, montrant la possibilité de réarrangements multiples, donc d'expression possible de plusieurs spécificités par une seule cellule ou un clone.

Ces questions sont revenues au premier plan avec le concept de receptor editing, qui permet l'échappement de lymphocytes B auto réactifs à la sélection négative [30]. Au cours de l'ontogenèse, comme pour le récepteur des cellules T (TCR), les lymphocytes B qui expriment de façon aléatoire un récepteur auto immun sont éliminés. Un mécanisme d'échappement peut se produire par un second réarrangement, conduisant à la synthèse d'une seconde chaîne H ou L non auto réactive, qui se substitue à la chaîne initiale [31]. Il ne fait plus de doute que des réarrangements productifs successifs sont possibles au niveau des lymphocytes B normaux et que ces réarrangements constituent une condition importante de la tolérance B. D'après des travaux récents, 2–0% des IgLκ exprimées par les cellules B murines en voie de différenciation sont générés après réarrangements Vκ–Jκ multiples, et 20% environ de cellules B matures au cours de leur développement réarrangent les deux allèles L [32]. La machinerie enzymatique RAG reste donc fonctionnelle pour des réarrangements successifs, au moins de la chaîne L, que ce soit en cis ou en trans [33]. Une étape importante est donc franchie vers la bipotentialité des cellules B. Cependant, pour que l'editing soit fonctionnel dans les models auto-immuns, il est important que la chaîne originale anti-self ne puisse s'associer à la chaîne H avec expression membranaire du récepteur. Auquel cas, l'existence de deux récepteurs risquerait de perturber la sélection négative par baisse d'affinité pour l'antigène self. Or, les travaux de Weigert [34] sur des souris transgéniques, le transgène étant une chaîne H anti-ADN, montrent qu'un certain nombre de cellules B présentent des « doubles producteurs » par editing d'une chaîne Lκ endogène, qui inhibe la liaison du BCR au DNA. L‘autre récepteur, formé par la chaîne H associée à la chaîne Lλ endogène, présente toujours une activité anti-ADN. Des « doubles producteurs » sont ainsi formés par inclusion isotypique. Le travail récent de Gerdes et Wabl [3] présente des résultats dans un autre modèle de souris transgénique obtenue par transplantation du noyau entier d'un lymphocyte B différencié [35]. Ces souris montrent d'une façon surprenante un réarrangement productif des deux allèles de la chaîne. En créant ensuite des sous lignées avec différentes combinaisons alléliques, Gerdes et Wable décrivent une activité auto réactive d'un des allèles κ, avec une fréquence relativement élevée de lymphocytes B auto-réactifs, alors qu'elles auraient dû être éliminées pendant l'ontogenèse par sélection négative. Leurs analyses montrent qu'au cours de l'ontogenèse B s'opère d'abord un réarrangement productif de l'allèle κ, qui va s'associer à une chaîne Hμ pour former à la surface un BCR auto-réactif. Il est probable qu'après contact avec un auto-antigène provenant d'une cellule apoptotique, un réarrangement du second allèle κ s'est opéré, conduisant à l'expression d'une seconde chaîne légère. Elle va s'associer à la chaîne Hμ pour exprimer un second BCR non auto réactif, et ceci sur une même cellule B. L’editing est par conséquent intervenu par inclusion allélique, mais sans la destruction de la chaîne κ « anti-self ». Les « doubles », en sauvant des cellules B auto-réactives de la sélection négative leur ont permis de rejoindre le pool des cellules B matures. Ces « doubles producteurs » sont peut-être à l'origine des anticorps naturels circulants présentant une activité anti-self de faible affinité [36]. Ils permettent aussi de nouvelles perspectives quant à l'origine de certaines pathologies auto-immunes.

La notion d'editing, qui autorise dans certains cas la synthèse de deux types de BCR par une même cellule grâce à l'inclusion allélique, est donc essentiellement restreinte aux processus auto immuns. En ce qui concerne la chaîne Lκ, nous avons déjà vu que chez la souris normale, un nombre important de B matures opèrent des réarrangements multiples V–J sur le même allèle et aussi opèrent des réarrangements Lκ par inclusion allélique [32]. En prenant en compte un réarrangement multiple possible des chaînes lourdes [31], l'hypothèse selon laquelle le réarrangement en cis ou l'editing constitueraient des facteurs d'amplification importante du répertoire global des Ig est envisageable. Nos travaux sur la variation clonale « in vitro » [14], dans lesquels environ 25% des clones anti-haptènes changent de spécificité, suggèrent fortement que ces réarrangements multiples trouvent une expression membranaire à certains stades de la différenciation B. Dès nos premiers travaux, nous observions que les « doubles » ne concernaient « in vivo » que l'étape précoce de la réponse immune, quand les cellules B matures sont en voie de différenciation. C'est probablement à ce stade que les réarrangements multiples sont productifs et deviennent un facteur d'amplification du répertoire [37].

La théorie clonale a été un outil fructueux pour la compréhension de la diversité des Ig et la compréhension du système immunitaire en général. La tolérance dans sa formulation préfigurait notamment la notion de sélection négative T et B. Cependant, figer la théorie dans ses concepts initiaux ne pouvait que l'appauvrir. L'existence des « doubles producteurs » est maintenant prouvée, grâce aux outils de biologie moléculaire. Les travaux obtenus avec des antigènes hétérologues suggèrent que les « double producteurs » sont probablement un élément d'amplification de la diversité du répertoire des immunoglobulines. Dans une revue intitulée Death of a dogma ? [38], Melchers, commentant les travaux de Gerdes et Wabl, écrit : « Identification of a true functionally double-immunoglobulin producing cell indicate these ‘undogmatic’ B cells in the immune system should be sought at sites not yet searched. » En fait, ces cellules undogmatic avaient déjà été recherchées et trouvées dans les organes lymphoïdes secondaires de la souris. Plus intéressante, cette histoire montre une fois de plus qu'une théorie, aussi fructueuse soit-elle, ne gagne en rien à être érigée en dogme.