3.1.1 Composition des parois cellulaires d'origine végétale

Les études par RMN du solide des biopolymères représentent, depuis plusieurs années, un véritable challenge. En effet, ces molécules à l'état solide présentent des interactions dipolaires et une anisotropie de déplacements chimiques telles que leur spectre RMN est souvent ininterprétable, composé de raies très larges et superposées. Ces interactions anisotropes ont rendu pendant très longtemps l'analyse des biopolymères par RMN du ¹H très difficile par les techniques classiques. Cependant, depuis le développement de la technique de la rotation à l'angle magique (MAS, Magic-Angle Spinning [14a,14b]), il est possible d'enregistrer des spectres RMN sur lesquels on est capable de distinguer des raies à des déplacements chimiques différents, attribuables aux molécules étudiées. La technique MAS est couramment utilisée pour étudier des mélanges de biopolymères comme les parois cellulaires des végétaux (c'est-à-dire mélanges de cellulose, hémicelluloses, pectines, polymères phénoliques tels que lignine et subérine) [15–19]. Leur composition et leur structure tridimensionnelle varient selon l'espèce végétale, la maturité, le type de cellules, etc. [1].

Chez la tomate, plante modèle des fruits charnus, les cellules du péricarpe présentent une paroi de type primaire, hydrophile, quasiment dépourvue de lignine et riche en polysaccharides pectiques. Leur caractérisation par des méthodes physicochimiques modernes est facilitée par des méthodes d'extraction douces, permettant ainsi de préserver la structure et les interactions de ces polysaccharides.

La Fig. 3 représente les spectres de RMN ¹H du matériel insoluble à l'alcool (MIA) des cellules du péricarpe d'une tomate verte (TV) et d'une tomate rouge mature (TR). L'attribution des résonances a été réalisée à partir de spectres ¹H et ¹³C de haute résolution (Figs. 4 et 5) en utilisant la technique HRMAS (High-Resolution Magic-Angle Spinning), combinée à des recherches bibliographiques sur les données spectrales déjà publiées (voir les références dans [20]). Le Tableau 1 regroupe les déplacements chimiques ¹H et ¹³C et l'attribution des signaux détectés sur les spectres des Figs. 3 et 5.

Les signaux détectés sur les spectres des résidus de tomates vertes correspondent à l'amidon et aux constituants majoritaires des parois : les pectines et plus précisément, des α-1,5 arabinanes (Ara), β-1,4 galactanes (Gal), α-1,4 galacturonanes (AGal) et α-1,2 rhamnoses (Rha). Le pic observé à 1,25 ppm sur les spectres ¹H (Fig. 3) donne des taches de corrélation sur les spectres 2D-TOCSY (Fig. 4), avec des signaux à 0,82, 1,5, 1,98, 2,19, 2,17 et 5,26 ppm, suggérant son attribution à des groupements méthylène (CH₂)_n de lipides insaturés. Les signaux notés α et β sur le spectre ¹³C en détection directe (Fig. 5) sont attribués aux terminaisons réductrices des oses.

Les différents spectres ¹H et ¹³C indiquent clairement des modifications de composition liées aux phénomènes de maturation de la tomate. Les changements majeurs entre les résidus de tomates vertes et ceux extraits des tomates rouges concernent les chaînes de β-1,4 galactanes et l'amidon. Ce dernier, contaminant les préparations pariétales, est utilisé comme source d'énergie par la plante et diminue en quantité pendant la maturation. La perte des signaux carbone caractéristiques des pectines (β-1,4 galactanes (Gal), α-1,4 galacturonanes (AGal) et α-1,2 rhamnoses (Rha)) reflète leur décomposition pendant la maturation. Ce phénomène s'accompagne de l'élimination d'esters méthyliques présents au niveau des acides galacturoniques pectiques, comme on peut l'observer sur les spectres ¹³C à 176 ppm, signal caractéristique de la fonction acide dé-estérifiée des pectines (Fig. 5). Ces travaux permettent de montrer que la RMN est un outil adéquat pour suivre des changements structuraux dûs à des phénomènes biochimiques complexes, comme ceux qui sont liés à la maturation des fruits charnus. Il faut toutefois souligner que les expériences bidimensionnelles haute résolution utilisées pour ces travaux peuvent durer jusqu'à 48 h. Ce type d'acquisition, réalisée sur une poudre réhydratée, ne peut se faire que sur des échantillons peu fragiles et n'évoluant pas dans le temps à température ambiante.

3.1.2 Structure de la cellulose

La caractérisation structurale et dynamique des biopolymères en utilisant la RMN du solide du ¹³C est possible depuis le développement de la technique de rotation à l'angle magique couplée à la polarisation croisée (CPMAS, Fig. 1). Grâce à cette méthode, un transfert de cohérence entre un noyau abondant (proton en général) et un autre peu abondant (dit rare, comme le ¹³C) permet d'augmenter la sensibilité du noyau rare. La séquence consiste à irradier les deux noyaux simultanément (spin-lock ou contact) et de façon contrôlée (condition de Hartmann–Hahn) [5a] et d'acquérir le signal RMN du noyau rare en appliquant un découplage dipolaire sur les protons [5b].

L'application de la technique CPMAS pour les études structurales et conformationnelles des constituants des parois cellulaires date de 1980, lors de la découverte par Atalla et al. [21] d'un spectre RMN ¹³C de cellulose présentant des signaux distincts prouvant l'existence de deux allomorphes Iα et Iβ. Il a été montré que la forme cristalline Iα correspond à un arrangement d'une simple chaîne de glucose dans une maille triclinique, alors que la phase Iβ est monoclinique et caractérisée par deux chaînes parallèles [22a,22b]. Les celluloses natives sont en fait composées d'un mélange de ces deux phases cristallines, le rapport Iα/Iβ dépendant de la source botanique des fibres de cellulose, mais également des conditions environnementales lors de la croissance de la plante ayant produit ces fibres [23a,23b]. Il a également été démontré que la phase Iα est métastable, pouvant être convertie en Iβ par des traitements hydrothermiques à 260 °C [24]. D'autres études par RMN haut champ ont permis de prouver son efficacité pour l'estimation du taux de cristallinité et de la taille latérale des microfibrilles de cellulose [25a,25b]. Un exemple de spectre CPMAS de cellulose est présenté sur la Fig. 6. Il s'agit du spectre de la tunicine (cellulose de tunicier, organisme marin) sur lequel on observe quatre massifs correspondant à la résonance des six carbones des cycles de glucose de la cellulose. Le premier massif situé à haut champ entre 60 et 70 ppm est attribué au carbone C6, alors que le large pic situé entre 70 et 80 ppm représente la résonance des carbones C2, C3 et C5. Le massif du carbone C4 résonne entre 80 et 90 ppm, et finalement le pic situé autour de 104 ppm correspond au carbone C1. Pour cet échantillon, le carbone C1 présente deux pics distincts à 105,7 et 103,8 ppm attribués à la phase cristalline Iβ. Afin d'évaluer le rapport allomorphique Iα/Iβ et le taux de cristallinité de la tunicine étudiée, nous avons procédé à une décomposition spectrale des signaux C1 et C4. La décomposition du C1 a permis d'estimer le rapport Iα/Iβ à 0,3 (23/76). Le carbone C4, quant à lui, présente la caractéristique de résonner sur une large gamme spectrale (environ 10 ppm) avec une raie large entre 80 et 86 ppm attribuée aux C4 des chaînes de glucose amorphes (en surface et dans les défauts cristallins des microfibrilles), et un deuxième massif entre 86 et 90 ppm, caractéristique du cœur cristallin des microfibrilles de cellulose. Le rapport entre les intégrales de ces deux raies permet de calculer un taux de cristallinité de 84%. Cet exemple permet de démontrer l'intérêt de la RMN du solide pour la caractérisation structurale des celluloses. Cette méthode est complémentaire de la diffraction des rayons X, qui ne permet pas de distinguer entre les formes cristallines Iα et Iβ. Cependant, la quantification des spectres CPMAS est fortement dépendante, d'une part, de la mobilité des noyaux de la molécule étudiée et, d'autre part, de l'opérateur qui décompose les spectres en raies élémentaires afin de mettre en évidence les composantes des massifs complexes. En effet, la dynamique de la polarisation croisée doit être bien maîtrisée avant toute quantification. Pour chaque échantillon, des spectres enregistrés à différents temps de contact permettent de reconstruire une courbe d'aimantation et ainsi d'estimer le temps de contact nécessaire pour un maximum de transfert d'aimantation entre les protons et les carbones des molécules étudiées. En ce qui concerne les logiciels de décomposition spectrale, la plupart sont basés sur des algorithmes d'optimisation de la distance quadratique entre les données expérimentales et le modèle en variant les paramètres de chaque raie (largeur à mi-hauteur, intensité, déplacement chimique et allure –gaussienne ou lorentzienne). Cette méthode exige une bonne connaissance des molécules analysées afin d'imposer des contraintes d'ajustement à l'algorithme de décomposition. En général, le taux de cristallinité est connu par ailleurs (mesurée par DRX) ce qui permet d'imposer des surfaces de raies caractéristiques des structures cristallines. Le deuxième inconvénient de la méthode provient du fait qu'elle n'assure pas l'unicité de la solution proposée. Le nombre de raies d'un massif n'est pas limité et dépend seulement du choix de l'opérateur.

3.1.3 Structure de l'amylose

Malgré un gain en signal et en temps non négligeable, la méthode d'acquisition CPMAS permet d'enregistrer un spectre de polysaccharides qui peut prendre plusieurs heures. La préparation d'échantillons enrichis en ¹³C devient alors un véritable enjeu. Nous avons, pour la première fois, synthétisé in vitro de l'amylose du type B enrichi en ¹³C (à 100%), présentant un taux de cristallinité de 90% [4]. La Fig. 7 présente un spectre CPMAS de l'amylose enrichie en ¹³C enregistré en moins de 2 min au lieu de plusieurs heures pour l'amylose en abondance naturelle en ¹³C. Le spectre est caractéristique d'un polymère de glucose présentant trois massifs, l'un attribuable au carbone anomérique C1 à 100 ppm, l'autre autour de 72 ppm, correspondant aux carbones C2, C3, C4, C5 et le dernier à 60 ppm attribué au C6. Le signal du carbone C1 se présente en quadruplet, alors que l'amylose de type B est caractérisé par une symétrie des chaînes de glucose, donnant un doublet du C1 en RMN [26–30]. Il a été montré que la multiplicité des raies, et en particulier de celle du carbone C1 de la liaison glucosidique, était liée à la symétrie et à l'arrangement en doubles hélices des chaines d'amylose dans la maille cristalline. Pour l'allomorphe de type A, l'empilement est de type monoclinique. Chaque brin de double hélice est généré par un axe d'ordre 2, l'unité répétitive étant le maltotriose. Trois conformations différentes des liaisons glucosidiques sont nécessaires pour définir la double hélice constituant le type A, ce qui explique l'observation d'un triplet en RMN pour le carbone C1. Dans l'allomorphe B, les doubles hélices sont générées par un axe d'ordre 3₁, l'unité répétitive est le maltose possédant deux conformations différentes des liaisons glucosidiques ce qui explique l'observation d'un doublet en RMN pour le carbone C1. Ici, le dédoublement du carbone C1 en quadruplet (Fig. 7) est dû aux couplages scalaires entre les carbones C1 et C2, observables pour des molécules enrichies en ¹³C à ces positions.

C'est depuis 1988, avec l'étude des effets de la résonance rotationnelle dans les solides, qu'un certain nombre de séquences couplant la rotation à l'angle magique et des impulsions de radiofréquence ont été développées dans le but de réintroduire les informations relatives aux couplages dipolaires et ainsi de mesurer des distances entre noyaux (voir les références dans [31]). Ces techniques sont connues sous le terme générique de méthodes de recouplage dipolaire. Une d'entre elles, appelée DARR pour Dipolar-Assisted Rotational Resonance [9], a été démontrée comme étant très efficace pour l'estimation de longues distances ¹³C–¹³C, même en présence de forts couplages entre carbones directement liés. De plus, cette séquence (Fig. 2) semble être moins sensible aux inhomogénéités de radiofréquence comparée à une autre expérience largement utilisée dans le domaine, la séquence RFDR (Radiofrequency-Driven Recoupling) [32]. La séquence DARR fonctionne sous la condition de résonance rotationnelle modifiée. La résonance rotationnelle est une méthode robuste qui permet de réintroduire des couplages dipolaires homonucléaires de façon sélective [33a,33b]. Pour cela, il faut régler la vitesse de rotation à l'angle magique de telle sorte qu'elle soit égale à un multiple entier de la différence de fréquence de résonance entre deux spins sélectionnés (équation (2)). Pour atteindre ces conditions, le découplage dipolaire C–H pendant le temps de mélange de l'expérience doit être complètement éliminé. Dans la séquence DARR, on applique la condition de résonance rotatoire pour laquelle la puissance de découplage hétéronucléaire C–H est égale à un multiple entier de la vitesse de rotation (équation (3)). Dans les conditions où n = 1 ou 2, les couplages dipolaires C–H notés D ne sont pas annulés et modifient la condition rotationnelle selon l'équation (4). C'est le recouplage dipolaire assisté à la condition de résonance rotationnelle (Dipolar-Assisted Rotational Resonance Recoupling).