Abridged English version
1 Introduction
Bacterial influence on minerals or complex silicates alteration has been studied for several years. However, few studies were able to show results on the alteration rate of these materials and on the mechanisms of interaction between water, materials and microorganisms. Some studies on bioalteration were limited to a physical description of materials altered by bacteria [4,31,33–35]. In other studies where the elements contained in the leaching solutions were analysed, aluminium was used as a tracer [18,26]. The reliability of this element is subject, however, to caution, since it can be partly incorporated into secondary minerals [12,13,27], and also can be complexed by siderophores [30]. In this last case, its apparent solubility could be increased and not be consistent with an increased alteration rate.
The incubation medium used in bioalteration studies should allow a good bacterial growth and also a precise measurement of the alteration rate of the materials. Most media commonly used by microbiologists contain high amounts of carbon, nitrogen, major elements like phosphates, iron, magnesium, and energy sources [25], but also quantitatively undefined trace elements present as contaminants, among them those usually used as reliable tracers in alteration rate studies, e.g., strontium or calcium.
Moreover, most incubation media are heavily buffered to maintain a physiological pH favourable to bacterial growth. Indeed, when materials under study can supply elements required for bacterial growth, then the composition of the defined medium should not include these elements, but should contain, however, the ones absent in the materials.
In the present study, the bacteria P. aeruginosa has been chosen because it is widespread in nature (e.g., [2,11,17]), and often used in bioremediation studies [1,2,16,23,32]. Alteration of two type of material were studied: a basaltic glass originating from the Fidji's in the South Pacific [14,15], and a reference french bottom ash given by the ‘École des Mines de Douai’. These materials are referred to as ‘basalte’ and ‘mâchefer’, respectively, in the present study.
2 Materials and methods
2.1 Elaboration of the incubation medium
The incubation medium, called Phosphate/Succinate or PS medium, was composed of succinic acid 4 g l−1; Na2HPO4 9 g l−1; (NH4)2SO4 1 g l−1 and NaOH 1.52 g l−1. No magnesium source was added since bacteria are able to use the magnesium present in materials [5]. Na2HPO4, together with NaOH, were used to buffer the medium at pH 6.7, and also as a source of phosphorus and sodium for the bacteria. Sterilization was done by filtration on 0.2-μm filters.
2.2 Bacterial growth
The growth of P. aeruginosa was followed by measuring the optical density at 610 nm using 18 × 180-mm tubes containing 7.5 ml of PS medium under shaking (200 rpm) during 48 h at 25 °C. Materials were added as grains of 100 to 125 μm in diameter (100 mg/tube), previously heat-sterilized at 180 °C during 2 h. Their compositions are given in Table 1.
Analyse chimique du verre basaltique (basalte) et du mâchefer d'incinération d'ordure ménagère (mâchefer)
Chemical analysis of the basaltic glass (basalte) and the bottom ash (mâchefer)
| % masse | SiO2 | Al2O3 | CaO | MgO | Na2O | K2O | Fe2O3 | MnO | TiO2 | P2O5 | |||
| Basalte | 50,10 | 14,60 | 12,00 | 7,42 | 2,39 | 0,11 | 11,50 | 0,18 | 1,31 | 0,12 | |||
| Mâchefer | 51,30 | 7,00 | 13,60 | 1,98 | 5,96 | 1,20 | 7,90 | 0,09 | 0,46 | 1,03 | |||
| mg kg−1 | Rb | Cs | Sr | Ba | Sc | V | Cr | Co | Ni | Cu | Zn | Y | Zr |
| Basalte | 0,67 | 0,07 | 99 | 35,00 | 40,60 | 294 | 293 | 45,49 | 82 | 65 | 81 | 29,60 | 75 |
| Mâchefer | 32,27 | 1,92 | 269 | 824 | 4,10 | 263 | 514 | 25,13 | 220 | 988 | 1626 | 12,40 | 142 |
| mg kg−1 | Nb | Mo | Cd | Sn | Sb | W | Pb | La | Ce | Nd | Th | U | |
| Basalte | 1,61 | 0,42 | 0,07 | 0,95 | 0,14 | 0,37 | 1,78 | 2,63 | 8,11 | 8,07 | 0,28 | 0,07 | |
| Mâchefer | 6,74 | 9,59 | 0,52 | 156 | 16,65 | 2,90 | 768 | 20,14 | 38,16 | 13,56 | 4,70 | 2,33 |
2.3 Chromatography
In order to remove the sodium from the incubation medium, allowing the analysis of trace elements, the cationic resin AG50W-X8 was chosen for its relatively low selectivity for sodium [9]. Chromatography was conducted in a quartz column of 0.5-cm diameter and 23.5-cm height, with a resin volume of 4.61 cm3. Calibration was made with PS medium supplemented with 100 ppb of each of the following elements: Cr, Co, Ni, Cu, Zn, Rb, Sr, Y, Zr, Mo, Cd, Sn, Sb, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Pb. 40 ml of this solution were evaporated to dryness. The residue, solubilized in 1.5 ml HCl 1 N, was loaded on the column and eluted successively with 13 × 1 ml HCl 1 N followed by 2×30 ml HCl 6 N. Each one of the resulting fractions was analysed by ICP/AES (Jobin-Yvon JY 124 spectrometer) and ICP/MS (Fisons VG PQ2+ spectrometer).
3 Results
3.1 Validity of the chromatographic procedure
In order to reach an accurate quantification of trace elements in the incubation medium and thus, to validly estimate part of the elements solubilized during the bioalteration process, the removal of most of the sodium content of the incubation medium was necessary. Results of the calibration control of the chromatographic procedure are reported in Table 2. It is shown that phosphates are not retained by the resin since eluted within the first fractions, while sodium was excluded a few fractions later, as expected. On the contrary, trace elements were quantitatively retained on the resin, and required a 6 N HCl elution to be excluded (fraction 14). Thus, the method allowed to selectively separate up to 99% of the sodium from the trace elements, which were recovered with a yield of 96–99%, depending on the element.
Résultat de la calibration de la colonne
Column calibration result
| Fraction | Elution | P % | Na % | Éléments traces % |
| 1 | 1 ml HCl 1 N | <0,01 | <0,01 | <0,01 |
| 2 | 1 ml HCl 1 N | 3,23 | <0,01 | <0,01 |
| 3 | 1 ml HCl 1 N | 74,14 | <0,01 | <0,01 |
| 4 | 1 ml HCl 1 N | 22,47 | <0,01 | <0,01 |
| 5 | 1 ml HCl 1 N | 0,09 | <0,01 | <0,01 |
| 6 | 1 ml HCl 1 N | 0,02 | <0,01 | <0,01 |
| 7 | 1 ml HCl 1 N | 0,03 | <0,01 | <0,01 |
| 8 | 1 ml HCl 1 N | 0,01 | 13,99 | <0,01 |
| 9 | 1 ml HCl 1 N | <0,01 | 65,74 | <0,01 |
| 10 | 1 ml HCl 1 N | <0,01 | 13,07 | <0,01 |
| 11 | 1 ml HCl 1 N | <0,01 | 6,45 | <0,01 |
| 12 | 1 ml HCl 1 N | <0,01 | 0,53 | <0,01 |
| 13 | 1 ml HCl 1 N | <0,01 | 0,20 | <0,01 |
| 14 | 30 ml HCl 6 N | <0,01 | <0,01 | 96 < E⁎ < 99 |
| 15 | 30 ml HCl 6 N | <0,01 | <0,01 | 0,45 |
⁎ Éléments traces.
3.2 Analysis of the elements contained in the PS medium
Preliminary experiments were conducted using a culture medium commonly used for growing P. aeruginosa, which is the CAA medium (Casamino acids 5 g l−1, K2HPO4 1.18 g l−1; MgSO4⋅7 H2O 0.25 g l−1). Chemical analysis of this medium revealed unexpected high contents in silicon and calcium (Table 3), and also a huge discrepancy in trace elements from one batch of casaminoacids to another (data not shown). Such medium is then unsuitable for our studies. As shown in Table 3, the ICP/AES analysis of the PS and CAA media revealed on the contrary very low concentrations of most of the contaminating major elements in PS medium (except Na and P).
Composition en éléments majeurs du milieu CAA et du milieu PS (ppm)
Composition of CAA and PS medium (ppm)
| CAA | PS | |
| Si | 3,40 | <0,01 |
| Al | 0,02 | 0,02 |
| Mg | 20,40 | 0,02 |
| Ca | 0,33 | <0,01 |
| Fe | 0,01 | 0,01 |
| Mn | <0,01 | <0,01 |
| Na | 726 | 3788 |
| K | 496 | 1,03 |
| P | 258 | 2032 |
Moreover, the trace element concentrations in the PS medium were found near or below the detection limit for a majority of them (Table 4). The PS medium is then more suitable than the CAA medium for our experiments.
Composition en éléments traces du milieu PS (ppb)
PS-medium trace-element composition (ppb)
| Éléments | ppb | Éléments | ppb |
| Cr | 4,75 | La | 0,01 |
| Co | 0,06 | Ce | 0,02 |
| Ni | 0,074 | Pr | <0,01 |
| Cu | 4,14 | Nd | <0,01 |
| Zn | 6,52 | Sm | <0,01 |
| Rb | 0,16 | Eu | <0,01 |
| Sr | 3,06 | Gd | <0,01 |
| Y | 0,01 | Tb | <0,01 |
| Zr | 1,52 | Dy | <0,01 |
| Mo | 0,95 | Ho | <0,01 |
| Cd | 0,06 | Er | <0,01 |
| Sn | 0,08 | Tm | <0,01 |
| Sb | 0,45 | Yb | <0,01 |
| Cs | 0,01 | Lu | <0,01 |
| Ba | 1,46 | Th | <0,01 |
| Pb | 0,01 | U | 0,33 |
3.3 Bacterial growth
A very faint growth of P. aeruginosa was observed following 48-h incubation at 25 °C in the PS medium (Fig. 1). As expected, the growth was considerably enhanced when iron and magnesium (100 μM FeCl3 and MgSO4⋅7 H2O at 0.25 g l−1) were added before inoculation, or when materials were supplemented (100 mg/tube), suggesting, indeed, that bacteria were able to fulfill their iron and magnesium requirements from the materials. Interestingly, from the growth curves reached respectively for basalt- and bottom ash-supplemented PS media compared to the Fe/Mg supplemented one (Fig. 1), it could be suggested that the two elements were provided to the bacteria in sufficient amounts from both materials. However, it could be postulated that another unknown element is specifically provided by bottom ash to the bacteria, resulting in a better growth (Fig. 1).
Suivi de croissance de Pseudomonas aeruginosa à 25 °C.
Growth of Pseudomonas aeruginosa at 25 °C.
4 Discussion and conclusions
- • The PS medium developed in this study allowed a good growth of P. aeruginosa when it was supplemented with iron and magnesium, or supplemented with materials, basalt or bottom ash, able to furnish these elements to the bacteria.
- • The PS medium contains very little amounts of Si, Al, Mg, Ca, Fe, Mn, K, as well as most of the trace elements quoted for a majority of them in concentrations equal or lower than the detection limits (0.01 ppb). Thus, the flux of such elements during biotic or abiotic alteration processes could be accurately measured by ICP/MS when the chromatographic procedure developed in the present study is used.
- • Long-term alteration assays on waste confinement matrix with or without the presence of bacteria are now in progress to evaluate the exact role of bacteria as well as their influence on the alteration rate of such materials. First experiments on bottom ash showed already that the alteration rate in the presence of P. aeruginosa was lower than in sterile assay. We are presently testing the hypothesis that such effect could be due to the formation of a biofilm protecting the material [6].
1 Introduction
L'influence des bactéries sur l'altération de minéraux ou de silicates complexes a fait l'objet de nombreux travaux. Peu d'entre eux, cependant, donnent des informations sur la vitesse d'altération et sur les mécanismes d'interaction entre l'eau, les matériaux et les microorganismes. Ceci provient de la difficulté qu'il y a à obtenir des données quantitatives sur l'altération de minéraux dans le milieu naturel en présence de microorganismes, principalement à cause de l'impossibilité de comparer des systèmes identiques, mais stériles. Une autre difficulté consiste à trouver des traceurs fiables permettant une évaluation correcte de la vitesse d'altération au cours des expériences en laboratoire.
Certains travaux se référant à la bioaltération se limitent à la description de l'état physique des matériaux supposés altérés par des bactéries [4,31,33–35] et qui associent la vitesse d'altération à la colonisation bactérienne [8]. La présence de structures particulières, telles que les hair channels, est attribuée à cette activité bactérienne [7], mais aucune information sur la solution altérante n'est donnée par les auteurs. Des travaux expérimentaux [10] impliquant la participation de sidérophores [3,21,22,28] (ligands synthétisés par la majorité des bactéries pour complexer le fer et le rendre biodisponible), traitent la dissolution d'oxydes de fer en présence de desferrioxamine B ou d'acide oxalique comme complexants du fer, mais sans la présence de bactéries. D'autres travaux expérimentaux faisant intervenir des bactéries, et dans lesquels la solution est analysée, utilisent l'aluminium comme traceur [18,26] ; ces travaux montrent une augmentation de la concentration en aluminium en présence de bactéries et concluent que ces bactéries provoquent une augmentation de la vitesse d'altération. Cependant, l'aluminium ne peut pas être considéré comme un bon traceur, puisque dans des essais stériles il entre facilement dans la structure de minéraux secondaires [12,13,27], alors qu'il peut rester en solution en présence de microorganismes, parce qu'il est complexé par des sidérophores [30]. Dans le second cas, la concentration de l'aluminium est élevée en solution, sans pour autant que l'on puisse conclure à une augmentation de la vitesse d'altération. Enfin, des travaux ont été conduits sur l'interaction ciments–bactéries de type Thiobacillus thiooxidans [19,20,24,29]. Ces bactéries sont connues pour leur capacité à produire des acides, tels que l'acide sulfurique, durant leur phase de croissance selon la réaction simplifiée :
Dans les expérimentations faisant intervenir des bactéries, le choix d'un milieu d'incubation doit répondre à deux exigences : permettre une croissance bactérienne conséquente et une évaluation de la vitesse d'altération des matériaux. Dans le cas des travaux publiés, les milieux d'incubation utilisés favorisent une croissance bactérienne, mais ne présentent pas un degré de pureté suffisant pour permettre, grâce à des traceurs fiables, une évaluation correcte de la vitesse de dissolution des matériaux [25]. Le problème majeur est que la plupart des milieux d'incubation proposés par les bactériologistes contiennent de fortes proportions d'éléments traces, candidats potentiels au traçage de la vitesse comme le strontium ou le calcium, par exemple.
Un milieu d'incubation doit contenir une source de carbone et d'énergie, une source d'azote, et des éléments minéraux tels que phosphore, magnésium, fer, sodium, potassium [25]. De plus, la majorité des milieux d'incubation sont tamponnés pour rester dans la gamme de pH favorable à une croissance bactérienne.
Il est à noter que les matériaux testés peuvent apporter tout ou partie des oligoéléments nécessaires à une croissance bactérienne [5]. De ce fait, le milieu de culture choisi doit simplement fournir aux bactéries les constituants absents du solide considéré, ou éventuellement présents en quantité trop faible.
La bactérie P. aeruginosa a été retenue pour cette étude parce qu'elle est très répandue dans la nature (par exemple, [2,11,17]), et qu'elle a déjà fait l'objet de plusieurs études dans le domaine de la bioremédiation [1,2,16,23,32]. C'est une bactérie à Gram négatif, mobile par flagellation polaire, à métabolisme respiratoire et hétérotrophe. Pour tester la croissance de la bactérie dans le milieu d'incubation élaboré, deux matériaux pourvoyeurs potentiels d'oligoéléments, ont été étudiés : un verre basaltique d'origine marine, provenant de l'Arc des Fidji dans le Pacifique sud [14,15] et un mâchefer d'incinération d'ordures ménagères (MIOM) de référence fourni par l'École des Mines de Douai, nommés respectivement « basalte » et « mâchefer » dans le présent travail.
2 Matériels et méthodes
2.1 Élaboration du milieu d'incubation
Le milieu d'incubation proposé au cours de cette étude contient les composés suivants : acide succinique 4 g l−1 ; Na2HPO4 9 g l−1 ; (NH4)2SO4 1 g l−1 et NaOH 1,52 g l−1. Ce milieu, appelé phosphates/succinate ou milieu PS, ne contient pas de source de magnésium, puisqu'il a été montré que la bactérie est capable d'utiliser celui apporté par les matériaux [5]. Na2HPO4 et NaOH permettent de tamponner le milieu à pH 6,7 et jouent également le rôle de sources de phosphore et de sodium pour les bactéries. Le milieu a été stérilisé par filtration à 0,2 μm dans des bouteilles stériles en polypropylène et stocké à 4 °C.
Les sels de sodium plutôt que de potassium ont été préférés dans l'élaboration du milieu PS, pour deux raisons majeures :
- (i) permettre de séparer sur colonne chromatographique le sodium et les phosphates et récupérer tous les autres éléments majeurs et traces pour les doser par ICP/AES (spectromètre Jobin-Yvon JY 124) et par ICP/MS (spectromètre Fisons VG PQ2+) – la limite de détection est de 10 ppb pour les majeurs et de 10 ppt pour les traces ;
- (ii) permettre de doser la quantité de potassium issue des matériaux par les méthodes conventionnelles d'analyse.
2.2 Croissance bactérienne
La croissance de P. aeruginosa a été suivie par mesure de la densité optique à 610 nm, dans des tubes de 18 × 180 mm contenant 7,5 ml de milieu PS sous agitation (200 rpm) pendant 48 h à 25 °C, avec ou sans matériau ajouté (100 mg/tube). Les matériaux dont la composition est donnée dans le Tableau 1 ont été utilisés sous forme de grains obtenus par broyage, tamisage entre 100 et 125 μm de diamètre, lavage à l'alcool, puis stérilisation par chauffage à 180 °C pendant 2 h.
2.3 Chromatographie
La teneur en sels dissous du milieu PS étant de 15,52 g l−1, il faut le diluer au moins 10 fois en vue de son analyse chimique par ICP/MS, ce qui rend le plus souvent impossible la détection d'éléments traces dissous durant l'altération des matériaux. Une diminution de la charge pondérale sans dilution est alors indispensable pour la détection des éléments traces. Ainsi, un traitement par colonne chromatographique a été élaboré pour éliminer sélectivement le sodium et les phosphates de la solution d'altération, tout en conservant les traces.
La résine cationique AG50W-X8 a été choisie pour sa faible sélectivité relative pour le sodium [9]. Les anions, en particulier les phosphates et les sulfates, ne sont pas retenus par la résine. Celle-ci, ayant une sélectivité de 1,5 pour le sodium, permettra son élution, alors que tous les autres cations, ayant une sélectivité supérieure à 2,35, seront retardés.
La chromatographie a été conduite dans une colonne en quartz de 0,5 cm de diamètre et de 23,5 cm de hauteur, le volume occupé par la résine étant de 4,61 cm3. La résine a été préconditionnée par une succession de lavages faisant intervenir successivement 10 ml des solutions suivantes : HNO3 0,25 N ; HNO3 7,5 N ; H2O ; HCl 0,5 N ; HCl 6 N et H2O. Ce traitement a été répété trois fois. Les solutions utilisées ont été préparées à partir de produits de qualité Suprapur (Merck).
En utilisant des solutions standard, nous avons préparé pour des essais de calibration une solution de milieu PS enrichie à 100 ppb pour chacun des éléments suivants : Cr, Co, Ni, Cu, Zn, Rb, Sr, Y, Zr, Mo, Cd, Sn, Sb, Cs, Ba, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Pb. Un volume de 40 ml de cette solution a été évaporé et le résidu, repris par 1,5 ml d'HCl 1 N, a été traité sur la colonne par élution fractionnée (13 × 1 ml HCl 1 N, puis 2 × 30 ml d'HCl 6 N). Pour chaque fraction tous les éléments traces cités ci-dessus ont été dosés par ICP/AES et ICP/MS.
3 Résultats
3.1 Validité de la séparation par chromatographie
Afin d'analyser les éléments traces du milieu d'incubation et estimer la quantité solubilisée pendant le processus de bioaltération, la séparation de la majeure partie du sodium du milieu d'incubation était nécessaire. Les résultats de la calibration de la colonne sont reportés dans le Tableau 2. On remarque que le phosphore, qui est sous forme anionique, n'est pas retenu par la résine, son élution s'effectue dans les premiers millilitres de HCl 1 N. L'élution du sodium commence à partir du huitième millilitre de HCl 1 N et se termine au treizième millilitre. En revanche, les éléments traces, fortement retenus par la résine, sont élués par HCl 6 N dans la quatorzième fraction, avec un rendement qui varie entre 96 et 99 % suivant l'élément. La concentration initiale étant de 3788 ppm de sodium et 0,1 ppm d'éléments traces, nous estimons satisfaisante la calibration de la colonne, qui permet de séparer sélectivement 99 % de sodium, tout en conservant entre 96 et 99 % des éléments traces.
3.2 Analyse chimique du milieu PS de référence
Les premières expériences ont été faites à partir d'un milieu de culture (milieu CAA) formé de : casaminoacides 5 g l−1 ; K2HPO4 1,18 g l−1 ; MgSO4⋅7 H2O 0,25 g l−1. Ce milieu contient des quantités non négligeables de Si, Ca, Na et K (Tableau 3), qui rendent impossible la détection de ces éléments libérés en faible quantité durant l'altération. Les casaminoacides résultent d'un hydrolysat de caséine, dont la composition en acides aminés ainsi qu'en éléments traces n'est pas stable d'un lot de production à l'autre, comme nous avons pu le constater, ce qui rend impossible l'utilisation de ce milieu dans nos études. Le dosage par ICP/AES du milieu PS (Tableau 3) montre une faible concentration de l'ensemble des éléments majeurs par rapport au milieu CAA, à l'exception du sodium et du phosphore, ce qui était recherché. Le milieu PS étant dépourvu des oligoéléments tels que Fe, Mg, K, et Ca, la bactérie doit satisfaire ses besoins en les recherchant dans les matériaux testés.
La teneur de ce milieu en éléments traces (Tableau 4) montre que la concentration de la majorité de ces éléments est proche de la limite de détection (0,01 ppb), voire inférieure. La pureté du milieu PS est donc satisfaisante pour étudier quantitativement l'influence des bactéries sur l'altération des silicates complexes.
3.3 Croissance bactérienne
Comme il fallait s'y attendre, une très faible croissance bactérienne est observée dans le milieu PS de référence après 48 h d'incubation à 25 °C (Fig. 1). La croissance est considérablement augmentée lorsque du fer et du magnésium (100 μM FeCl3 et MgSO4⋅7 H2O à 0,25 g/l) sont ajoutés au milieu PS. Par ailleurs, l'ajout des matériaux (mâchefer ou basalte, 100 mg/tube) au milieu PS provoque aussi une stimulation de la croissance, ce qui suppose que les bactéries utilisent le fer et le magnésium des matériaux. D'autres éléments sont probablement fourni aux bactéries spécifiquement par le mâchefer ce qui expliquerait la plus forte croissance bactérienne en sa présence (Fig. 1).
4 Conclusions et discussion
- • Le milieu PS développé pour cette étude à partir de produits chimiques purs permet une bonne croissance de P. aeruginosa, à condition qu'il soit supplémenté par du magnésium et du fer. La présence de verre basaltique ou de mâchefer d'incinération d'ordure ménagère dans le milieu PS peut pallier à cette carence, les éléments (Fe, Mg) pouvant être fournis par la dissolution de ces matériaux [5].
- • Le milieu PS est « carencé » en Si, Al, Mg, Ca, Fe, Mn, K, ainsi qu'en la majorité des éléments traces, ce qui permet d'analyser avec précision ces éléments au cours de l'altération des matériaux.
- • Une colonne chromatographique a été développée pour séparer le phosphore et le sodium présents dans le milieu d'incubation, tout en gardant les éléments traces, ce qui permet leur détection par ICP/MS sans aucune dilution.
- • Des essais d'altération à long terme de matrices de confinement de déchets en présence de bactéries sont en cours afin d'évaluer le rôle exact des bactéries ainsi que leur influence sur la vitesse d'altération. Des expériences réalisées avec des mâchefers montrent que la vitesse d'altération en présence de P. aeruginosa est plus faible qu'en milieu stérile. Ceci pourraît être attribué à la formation d'un biofilm protecteur [6].
Remerciements
Ce travail a été supporté financièrement par le programme REALISE (RÉseau Alsace de Laboratoires en Ingénierie et Sciences pour l'Environnement). Nous remercions Christelle Gruffaz et Alain Arth pour leur assistance technique ainsi que René Boutin pour les analyses ICP-MS. Merci également à Alain Decarreau et à un expert anonyme pour leurs remarques constructives du manuscrit. Cette note constitue la contribution EOST 2005.402 (UMR7517).