Les semis ont été réalisés dans une parcelle expérimentale à l'Institut national de recherche agronomique de Tunis (Inrat) et dans les conditions naturelles de culture. La parcelle a été subdivisée en deux blocs, un pour chaque variété. Notre choix à été porté sur deux variétés double zéro « 00 » et cultivées en Tunisie : Hybridol et Pactol. Les plantes ont été irriguées à l'eau du robinet. Les prélèvements ont été commencés dès l'apparition des premières siliques (soit 30 j après la floraison) jusqu'à la maturation complète des graines, à raison d'un prélèvement tous les huit jours pour chaque variété.

On a utilisé deux méthodes pour l'extraction des lipides totaux : la méthode de Folck et al. [9], qui a été utilisée pour l'analyse des tocophérols et acides gras totaux et la méthode Soxhlet [10] utilisée pour déterminer la teneur en huile et l'indice de peroxyde.

Elle a été réalisée selon la méthode officielle AOCS Cd 8–53 (92) (American Oil Chemist's Society). Cette méthode consiste d'abord à préparer un mélange acide acétique/chloroforme dans les proportions 3v/2v. Une solution d'iodure de potassium (KI) est obtenue en dissolvant 13,33 g de KI dans 10 ml d'eau distillée dans un flacon brun. Une solution de thiosulfate de sodium (0,1 N) a été utilisée pour le titrage. Une solution d'amidon de patate a été obtenue en dissolvant 1 g d'amidon dans 200 ml d'eau distillée (la solution a été portée à ébullition pendant quelques secondes, puis mise au réfrigérateur).

On a dissout 5 g d'huile dans 30 ml du mélange acide acétique/chloroforme. On a ajouté 0,5 ml de la solution de KI, puis on a agité pendant 1 min exactement. La réaction a été arrêtée par l'addition de 30 ml d'eau distillée. La titration a été réalisée par la solution de thiosulfate de sodium 0,1 N en présence de quelques gouttes d'amidon de pomme de terre.

Dans une série de tubes en verre, on a mis 100 μl d'huile, on lui a ajouté 100 μl de standard interne rétinol–acétate et 200 ml d'eau physiologique (eau salée 0,9%). On a agité pendant 5 min, puis on a ajouté 200 μl d'hexane et on a centrifugé à 4000 rpm pendant 5 min. On a récupéré la phase supérieure, on l'évaporée, puis reprise dans 50 μl d'éthanol. On a injecté 20 μl de l'échantillon.

Le système chromatographique utilisé est une chaîne HPLC (type : Shimadzu) composée par une pompe LC-7A, un injecteur Rheodyne 127 menu d'une boucle de 20 μl, d'un détecteur UV (290 nm) et d'un intégrateur C-R6A Chromatopac. La colonne contient une phase stationnaire de silice greffé par des groupements octa-décyl (C18) Lichrospher 100 RP-18 (5 μm, 250×4mm) Merck 50883. La phase mobile est constituée de méthanol pur. Les conditions chromatographiques sont les suivantes : débit, 1,5 ml min⁻¹, température, 40 °C.

Pour la méthylation des acides gras, nous avons utilisé la technique de Metcalfe et al. [11], modifiée par Lechevallier [12]. Les esters méthyliques des acides gras ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse (CPG) à l'aide d'un chromatographe HP 4890 muni d'un détecteur à ionisation de flamme (FID) et équipée d'une colonne capillaire supelcowax^TM 10. Les températures de la colonne, du détecteur et de l'injecteur sont, respectivement, 200, 250 et 230 °C.

2.6.1 Extraction des protéines totales

2.6.2 Électrophorèse par SDS-PAGE

La Fig. 1 montre que chez les deux variétés, la teneur en huile augmente au cours du temps, puis marque une légère diminution à la fin de la maturation des graines des deux variétés. Les meilleures teneurs obtenues correspondent aux stades V et VI, soit deux et une semaine avant la maturation complète des graines, respectivement pour Hybridol et Pactol. La Fig. 2 montre que la deuxième composante du rendement (PMG) évolue progressivement au cours du temps, ce qui confirme la différence entre les profils électrophorétiques des protéines totales représentés par la Fig. 3. Les électrophorégrammes montrent bien que les protéines les plus représentées ont les masses moléculaires 35, 25, 15 et 10 kDa. Ces protéines correspondent probablement aux protéines majeures de réserve des graines de colza : la cruciférine, la napine et l'oléosine [14]. Les oléosines sont des protéines alcalines de poids moléculaire de 15–26 kDa. Essentiellement rencontrées au niveau des graines, elles jouent un rôle très important dans la stabilisation des TAG dans la matrice des oléosomes. Elles sont connues aussi comme un site spécifique de liaison des lipases au cours de la germination [15]. La relation entre l'accumulation des lipides et celle des protéines est encore ambiguë. En effet, certains auteurs ont suggéré que l'accumulation des lipides de réserve commence plusieurs semaines avant celle des protéines de réserve, alors que leur mobilisation ne commence qu'après celle des protéines. Il pourrait exister un mécanisme commun contrôlant la régulation de la synthèse et de la mobilisation des protéines majeures du colza et qui serait différent de celui mis en jeu dans la synthèse et la mobilisation des lipides de réserve [14].

La Fig. 4 montre que les teneurs de l'acide oléique (C18:1) évoluent progressivement au cours de la maturation des graines des deux variétés et présentent un maximum d'accumulation aux stades V et VI, respectivement pour Hybridol et Pactol. Ceci est probablement dû à la précocité de Pactol. Le C18:1 est l'acide gras le plus présent dans l'huile de colza, dont la teneur dépasse 60% pour Hybridol et Pactol. C'est un acide gras qui est présent dans la structure des triacylglycérols (TAG) et des glycérophospholipides (PL). Les AGPI (C18:2 et C18:3), dont les teneurs sont appréciables (16% et 8% respectivement), présentent un maximum d'accumulation à la mi-maturation, puis marquent une diminution à la fin de la lipogenèse. On explique ce phénomène par le fait que ces acides gras, en plus de l'acide oléique, entrent dans la constitution des phospholipides qui forment la structure des membranes cellulaires nouvellement formées. On a noté qu'au début de la maturation, la masse des acides gras insaturés ne représente qu'une faible fraction de la masse d'huile. Cette masse manquante est représentée effectivement par celle des acides gras saturés (C16 et C18 en particulier) et ceci est dû au fait que les réactions d'élongation et de désaturation sont très lentes à ce stade.

L'indice de peroxyde est par définition le nombre d'équivalents d'oxygène contenu dans 1 kg de produit et oxydant l'iodure de potassium avec libération d'iode. L'indice de peroxyde est une mesure de vieillissement d'une huile, cet indice augmente avec le temps. En effet, c'est au contact de l'oxygène de l'air qu'une huile s'oxyde et vieillit. Nous avons déterminé ce paramètre, d'une part, pour s'assurer de l'intégrité des huiles après les procédures d'extraction et de conservation et, d'autre part, parce que les phénomènes d'oxydation de l'huile engendrent, à côté de composés volatils responsables de flaveurs désagréables, des acides oxydés, qui se trouvent sous forme libre ou sous forme de glycérides.

Les niveaux de peroxydes évalués ne dépassent pas les 10 milliéquivalents d'oxygène actif par kilogramme d'huile chez les deux variétés. Ses valeurs indiquent un bon état de l'huile de deux variétés étudiées. Nous pouvons confirmer que tous les composés identifiés se trouvent naturellement dans l'huile de colza et ne sont pas des produits de dégradation de cette huile. La Fig. 5 montre bien que l'évolution des peroxydes suit l'allure générale de celle des tocophérols. En effet, durant la phase la plus active de l'accumulation des lipides (deux et une semaine avant la maturation complète des graines pour Pactol et Hybridol respectivement), le niveau des peroxydes augmente, ce qui entraîne l'élévation des teneurs en tocophérols qui participent à freiner et même à inhiber le processus d'oxydation des lipides, en particulier au cours de cette phase sensible d'accumulation. On signale que les tocophérols ne sont pas les seuls composés qui puissent protéger une huile contre l'oxydation naturelle des acides gras insaturés.

L'oxydation des acides gras est affectée par plusieurs facteurs, comme la lumière, la présence d'antioxydants et de pro-oxydants et le degré d'insaturation de ces acides gras. En effet, les acides polyinsaturés à longue chaîne, parce qu'ils se prêtent aux réactions radicalaires, sont particulièrement visés [16]. L'acide linolénique (C18:3), par exemple, a un taux d'oxydation 25 fois plus élevé que celui de l'acide oléique et deux fois plus rapide que celui de l'acide linoléique [17]. La grande stabilité des huiles végétales, dans les conditions d'oxydation, est due à la présence d'un taux élevé d'antioxydants naturels, dont les plus importants sont les tocophérols [5]. La Fig. 5 qui représente l'évolution des tocophérols au cours de la maturation des graines des deux variétés de colza montre que les teneurs en γ tocophérols sont relativement plus importantes que celles des α tocophérols et que le maximum d'accumulation a été observé aux stades V et VI, respectivement, pour Pactol et Hybridol. L'allure générale de l'évolution des tocophérols au cours du temps rappelle celle des acides gras insaturés. Cette probable corrélation positive est très importante, puisque l'huile de colza est hautement insaturée et présente des taux très élevés d'AGPI, lesquels sont des cibles potentielles d'oxydation naturelle. Les tocophérols protègent essentiellement contre l'oxydation de ces AGPI [18,19]. Ils « balaient » les radicaux libres et contribuent à la défense anti-oxygène et exercent leur effet antioxydant par de nombreux mécanismes biochimiques et biophysiques. En effet, une molécule de tocophérol peut protéger 103 à 106 molécules d'AGPI [6,8]. Les corrélations étudiées (r à 5%) entre AGPI et tocophérols au cours de la maturation des graines de colza sont 96% et 98% respectivement pour Hybridol et Pactol. L'étude de ces corrélations nous a permis donc de supposer que les AGPI induisent le taux des tocophérols dans les graines des deux variétés de colza au cours de la maturation. Mais on note que, bien que les quantités de ces deux composés évoluent de façon coordonnée sous le contrôle d'un phénomène commun situé en amont dans le métabolisme, il est possible que l'un de ces composés ne contrôle pas l'autre.

Chez les huiles végétales, dont le colza, il y a une corrélation positive entre l'α tocophérol et l'acide linoléique (C_18:2) et probablement entre le γ tocophérol et l'acide linolénique (C_18:3) [8].