2.1. The crucial role of pvdbp gene in the invasion of Duffy-positive reticulocytes

The P. vivax Duffy Binding Protein (pvdbp) gene encodes the invasion-related ligand P. vivax Duffy Binding Protein (PvDBP) [71]. The pvdbp gene displays coding sequences for a N-terminal signal peptide domain, a conserved cysteine-rich Duffy binding domain referred to as region II, another conserved cysteine-rich domain referred to as region VI, followed by a transmembrane domain and a C-terminal cytoplasmic tail [72]. Based on current high throughput sequencing data, our appreciation of genetic diversity is less and less limited by the nature and/or density of markers studied along the genome. Notably, the recent publication of more than two hundred P. vivax genomes showed that the pvdbp gene sequences were highly polymorphic irrespective of their geographic origin. Interestingly, many non-synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) were found in the DARC binding domain region II (PvDBPII) [53]. The diversity and localization of these SNPs suggest that the pvdbp gene may be under differential selective pressure due to antibody responses and its function in receptor-binding and invasion [51].

In addition, copy number variations (CNVs) at the pvdbp locus were found to be one of the most common gene expansions to occur across multiple alleles worldwide [73]. While the detection of CNVs relied, in the past, on labour intensive and costly techniques such as in situ hybridization, recent advances in high throughput sequencing enabled their direct detection based on sequencing data. Notably, whole genome sequencing approaches revealed two distinct duplications in parasites from Madagascar and Cambodia. In Madagascar, P. vivax isolates from Duffy-positive and Duffy-negative patients exhibited a common duplication with two copies of pvdbp next to each other [74]. In Cambodia, a different duplication of the pvdbp gene was commonly detected in P. vivax isolates from Duffy-positive patients. Furthermore, the proportion of P. vivax isolates carrying the duplication was found to be significantly higher in homozygous Duffy-positive patients than in heterozygous Duffy-positive patients who are expected to exhibit a lower expression of DARC on the surface of their reticulocytes. However, the latter analysis could not completely rule out that patients could carry multiple P. vivax clones while the estimation of CNVs by quantitative PCR can only reflect the major clone [53]. More recently, a geographical survey demonstrated that these two distinct duplications of pvdbp were circulating in Asia, South America, and East Africa. While Duffy negativity is prevalent in some regions, duplications of the pvdbp gene were also largely found in regions where Duffy negativity was almost absent [51]. In contrast, a concurrent genomic analysis showed that no duplication of pvdbp was found in one hundred eighty-two P. vivax isolates from eleven endemic countries. However, it was noticed that this discrepancy was probably due to the primers used for CNV validation by PCR [75].

Despite the specificity and distribution of the duplications of pvdbp, there was no evidence that P. vivax genomes bypassed the barrier of Duffy negativity through this genetic variation. Larger expansions of pvdbp were also detected worldwide. They clustered separately but presented similar patterns. High haplotype diversity was also observed between the copies while the 5′ and 3′ flanking sequences displayed moderate diversity [76]. In the Asia-Pacific region, sequencing of more than two hundred P. vivax isolates from Duffy-positive patients revealed the common presence of two to three copies of the pvdbp gene [73]. In Ethiopia, sequences of two P. vivax isolates from Duffy-negative patients exhibited the presence of three and eight copies of the pvdbp gene [57]. Later on, another common expansion of the pvdbp gene, quite similar to those previously described in Madagascar and Cambodia but ranging from three to five copies, was also detected [51]. These findings have therefore allowed to hypothesize that the expansion of pvdbp may allow for mutation arising in the second copy. Such expansions may facilitate the binding to an alternative erythrocytic receptor with a lower affinity for PvDBP ligand [57]. However, there is no evidence of localized-selected CNVs that would enhance invasion efficiency and induce selective pressure. Since the invasion of Duffy-positive erythrocytes depends on the interaction between PvDBP and DARC, it is likely that the expansions of pvdbp may be driven by genetic variations in DARC or inhibitory antibody responses to PvDBPII [75]. Nonetheless, it is unclear whether these expansions do provide an enhanced ability to the parasite to invade Duffy-negative erythrocytes.

2.2. The potential role of pvebp gene in an alternative invasion pathway

The P. vivax Erythrocyte Binding Protein (pvebp) gene was discovered through de novo assembly of one P. vivax isolate from Cambodia. It encodes the putative P. vivax Erythrocyte Binding Protein (PvEBP) ligand and is present in most P. vivax genomes. The organization of the pvebp gene is similar to the pvdbp gene with an N-terminal signal peptide, a Duffy binding like domain referred to as region II, another cysteine-rich domain referred to as region VI followed by a transmembrane domain and cytoplasmic tail [55]. Despite these similarities, pvebp appears to cluster separately from all known Plasmodium Duffy binding protein like genes. DNA sequencing of ten P. vivax genomes from Asia, South Pacific, Africa, Central and South America showed that pvebp is polymorphic though less diverse than pvdbp. Indeed, the pvebp gene displayed only 11 polymorphic sites in 2412 positions while the pvdbp gene displayed 32 polymorphic sites in 3213 positions for the same samples. Most of the SNPs detected were non-synonymous [55]. Furthermore, the genomic analysis of two hundred nineteen P. vivax isolates from Duffy-positive patients in Cambodia and Madagascar confirmed that pvebp was less diverse than pvdbp (12 vs. 33 alleles observed from the same isolates) but presented only non-synonymous mutations indicating the existence of a strong selective pressure. Indeed, eleven non-synonymous point mutations were found in pvebp sequences and led to twelve different alleles. Some SNPs were observed in both countries whereas others were specific to Cambodia and Madagascar. These SNPs were distributed across the Duffy binding like domain [53]. Just as for pvdbp, the diversity and distribution of SNPs in pvebp reflected the likely existence of a selective pressure in the pvebp gene though it seemed to operate at a lower level than in the pvdbp gene [58].

The genomic analysis of P. vivax isolates from Cambodia, Madagascar and Ethiopia also revealed the existence of copy number variations in the pvebp gene. In Madagascar, pvebp expansions were observed, ranging from two to five copies. A bimodal distribution of parasites with a specific population presenting more than three copies was found. However, no significant difference in susceptibility to vivax infection was observed between homozygous and heterozygous Duffy-positive individuals. In Cambodia, pvebp expansions ranged from one to two copies. The proportion of P. vivax isolates with multiple gene copies was more important in high transmission areas [53]. Overall, a high proportion of P. vivax isolates with multiple gene copies was found in Madagascar where Duffy-negativity and Duffy-positivity coexist as compared to Cambodia where Duffy-negativity is virtually absent. In contrast, no pvebp expansion was found in Ethiopia where Duffy-negativity is also frequent [51]. Considering the similarities observed between the pvdbp and pvebp genes, the polymorphism and expansion of pvebp may correlate with the expression of a new ligand interacting with erythrocyte membrane proteins other than DARC and therefore contribute to an alternative invasion pathway [55]. However, no evidence that such variations confer any abilities to infect Duffy-negative individuals have been provided so far.

2.3. The role of pvrbp and pvrbsa genes in reticulocyte selectivity

The P. vivax Reticulocyte Binding Protein (pvrbp) gene family was identified based on the annotation of adhesive ligands of P. vivax genome [69]. Genome sequencing of several P. vivax isolates identified eleven members in the pvrbp gene family including five full-length genes (pvrbp1a, pvrbp1b, pvrbp2a, pvrbp2b and pvrbp2c), three partial genes (pvrbp1p1, pvrbp2p1 and pvrbp2p2) and three pseudogenes (pvrbp2d, pvrbp2e and pvrbp3) [77]. The pvrbp genes are constituted of two exons with one exon encoding a signal peptide at the N-terminal region and another exon encoding a transmembrane domain at the C-terminal region [56]. Recent investigations reported that their genetic diversity seems to be generally low, except for the pvrbp2 genes [68]. The analysis of P. vivax isolates from China, Thailand and Ethiopia confirmed that pvrbp2c was highly polymorphic [51, 70, 59]. Although pvrbp2a and pvrbp2b presented highly conserved regions, the genomic analysis of P. vivax isolates from Papua New Guinea and Thailand showed that they were also relatively polymorphic [59, 60]. As observed for the pvdbp and pvebp genes, non-synonymous SNPs clustered around three main sites including the reticulocyte binding domain. This may reflect the functional importance of this binding site and the existence of a selective pressure [60].

Furthermore, CNVs affecting both pvrbp2a and pvrbp2b were observed in two P. vivax isolates from Thailand. While a strain presented duplication of both genes (pvrbp2a and pvrbp2b), the other strain had two copies of pvrbp2b only [59]. These findings suggest that the pvrbp genes may encode ligands involved in the recognition of target cells. The P. vivax reticulocyte binding surface antigen (pvrbsa) gene has also been identified as a gene potentially involved in the recognition of reticulocytes though it displays less genetic diversity than other P. vivax merozoite surface genes [63].

2.4. The potential role of pvmsp genes in primary attachment

The P. vivax merozoite surface protein (pvmsp) gene family encodes multiple antigenic determinants that are suspected to mediate the primary attachment between P. vivax merozoites and human reticulocytes [11]. These pvmsp genes are highly polymorphic. In particular, pvmsp1 [43], pvmsp3 [43, 78] and pvmsp7 [46] exhibit numerous non-synonymous SNPs indicating that they may be under selective immune pressure [51]. Analysis of P. vivax isolates from Ethiopia revealed that pvmsp3 presented copy number variations ranging from one to four copies. Interestingly, the expansions of pvdbp and pvmsp3 were often observed as tandem copies. The functional relevance of this expansion of copy numbers is still not known.

2.5. The other genes and their potential role in P. vivax invasion pathway

Other P. vivax genes are suspected to be involved in the invasion process. For instance, the P. vivaxtryptophan-rich antigen (pvtrag) gene family is thought to encode thirty-six proteins that can bind to human erythrocytes [79]. The genomic analysis of P. vivax strains from Ethiopia revealed that the pvtrag gene family seems to bear only a few genetic polymorphisms [51]. Similarly, the P. vivax glycosylphosphatidylinositol-anchored micronemal antigen (pvgama) gene encodes the P. vivax glycosylphosphatidylinositol-anchored micronemal antigen (PvGAMA) that binds erythrocytes regardless of Duffy antigen status [43]. This protein may play a role in the adhesion of P. vivax merozoites to its target cells [49]. Finally, the P. vivaxrhoptry neck protein (pvron) gene family encodes for P. vivaxrhoptry neck proteins (PvRON) that may participate in the formation of the tight junction as demonstrated for the P. falciparum homologs [67].

Genomic technologies clearly contributed to refine vivax malaria research by reducing the cost of sequencing as well as improving the quality and availability of sequences. However, only a few hundred P. vivax genomes have been sequenced so far. Field and clinical isolates present low parasitemia and high human DNA contamination that still make the acquisition of sufficient amount of high-quality parasite DNA difficult. Yet, the available genomic sequences have enabled the identification of a few potential invasion-related genes. Single nucleotide polymorphisms and copy number variations found in these genes may lead to structural differences and result in selective pressures, but the functional consequences of these variations remain unknown. Analysis of P. vivax genomes should be combined with the identification of their transcriptomic profiles and characterization of their putative proteins to detect specific signatures, which may provide insights into function. But the lack of in vitro culture methods for P. vivax makes functional analysis difficult.

3.1. Stage-specific expression of P. vivax invasion-related genes

Generating high quality transcriptomes across multiple P. vivax isolates is essential to explore the changes in gene expression throughout the intraerythrocytic cycle and leading to invasion. Recently, the single cell transcriptomics profiling in P. vivax isolates from bloodstream infections of Aotus and Saimiri monkeys revealed that most of the genes had a stage-specific expression and were strongly over-expressed, in contrast to housekeeping genes [5]. Given that most clinical infections were asynchronous, the analysis of P. vivax transcriptomes identified distinct populations. Rings and early trophozoites mainly expressed genes involved in transcription and translation whereas late trophozoites and schizonts possibly expressed invasion-related genes [5]. For instance, the pvebp and pvrbp1 transcripts were found to be highly expressed during P. vivax schizont stage [55, 56]. Similarly, the pvmsp3 transcripts were detected in very late schizonts [5] and the pvmsp7 transcript generally peaked during the late trophozoite-schizont transition, when merozoites are being formed [47]. In the primate model-adapted P. vivax strain (VCG-1), the pvron5 transcripts were found in schizonts [66]. Moreover, RNA sequencing experiments conducted with ex vivo P. vivax isolates from Brazil showed a wide variation in the expression of genes that were suspected to be involved either in the host-parasite interaction, reticulocyte selectivity or invasion. In particular, pvmsp1, pvmsp9, P. vivaxmerozoite surface antigen 180 (pvmsa180), P. vivaxrhoptry-associated membrane antigen (pvrama) and P. vivaxrhoptry H3 (pvrhoph3) were the most expressed among all genes [44]. The expression of invasion-related genes in late schizonts implies the key importance of merozoite development and reticulocyte invasion for P. vivax survival.

3.2. Selective expression of P. vivax invasion-related genes

The current P. vivax genome contains many gene families that were defined based on sequence homology and conservation of amino acid domains. Single-cell RNA sequencing analyses demonstrated that selective gene expression may be due to its specific role or additional functions. While most of the pvmsp genes are expressed during late developmental stages, pvmsp3 was found to be exclusively expressed in very late schizonts suggesting its role in the invasion process. More surprisingly, a pvmsp7 like gene appeared to be exclusively expressed in gametocytes implying a functional difference [5]. Comparable results were reported using clinical P. vivax isolates from Thailand. While the expression of most of the pvmsp7 genes was associated with schizonts, the pvmsp7a and pvmsp7f genes maintained high expression levels throughout the entire intraerythrocytic cycle. Such findings suggest that these paralogs may have additional functions besides their established role on the surface of merozoites [47]. Similarly, different expression levels were observed among members of the pvtrag gene family but their significance is unknown [5]. Despite their sequence homology, members of a gene family may also have different functions at specific time points [5]. Finally, a directional and amplification-free transcriptome (DAFT) sequencing of four P. vivax isolates from Cambodia revealed that transcription may be a selective process where the parasites would select particular members of a gene family in response to the host [80]. The authors showed that genes that were the most variably expressed among isolates physically clustered along chromosomal regions. For instance, the pvmsp3 locus presented many paralogs which were likely to be of functionally redundant thus increasing antigenic diversity and enhancing immune evasion during the invasion process. Within clusters, gene expression appears to arise as if parasites were choosing the gene version to be expressed within a given host [80]. Overall, these findings reflect a developmental regulation and functional differentiation within specific gene families.

3.3. Amplification of P. vivax invasion-related genes

In Plasmodium species, gene amplification may provide a simple way to increase gene expression and thereby changing invasion phenotypes. Previous genomic studies demonstrated that some P. vivax strains had amplification of invasion-related genes. Notably, the pvdbp gene is highly variable in the number of gene copies. For instance, transcriptomic profiling of schizonts from Cambodian P. vivax isolates revealed that the pvdbp gene amplification was associated with an increase in messenger RNA (mRNA) level, suggesting a potential increase in Pv DBP protein level [54]. Given that PvDBP protein plays a crucial role in the invasion of Duffy-positive reticulocytes, it was hypothesized that the parasites capable of infecting Duffy-negative reticulocytes may have been selected for their ability to use multiple copies of pvdbp in order to bind an alternative receptor [69]. However, P. vivax strains with multiple copies of pvdbp have also been commonly detected in regions where Duffy-negativity is rare. On another note, even though pvebp presents many similarities with pvdbp, there is no evidence that its amplification leads to increased mRNA and/or protein levels [53]. Thus, the functional consequences of invasion-related gene expansion are uncertain and require further investigations with a high number of P. vivax isolates.

3.4. A complex and dynamic regulation system

Transcriptomic data from individual parasites suggested that P. vivax exhibited a tightly regulated transcriptional cascade during its intraerythrocytic cycle [81]. Investigations showed that co-expressed genes presented conserved motifs, and potential sites for regulatory binding proteins [82]. For instance, long 5′ and 3′ untranslated transcribed regions (UTRs) were observed in genes suspected to be involved in the invasion and the formation of parasitophorous vacuole [80]. In addition, variations of 5′-UTRs seemed to lead to a differential selection of transcription start sites (TSS) reflecting the dispersed patterns of transcription that could arise [83]. The presence of bidirectional promoters to regulate the expression of adjacent gene pairs has also been frequently observed. Lastly, post-transcriptional modifications such as chromatin structure, non-coding transcripts and alternative splicing may play an important role in regulation, but the mechanisms remain unclear. Notably, the putative spatial relationship between genes which are variably expressed suggests that chromatin structure and access may be important for gene regulation [83]. Thus, P. vivax has an elusive and complex regulatory network that may govern invasion-related genes and thereby allow the parasite to thrive within infected human reticulocytes.

Transcriptomics provides precious insights into the dynamics of P. vivax invasion-related genes. It is likely that P. vivax schizonts selectively express specific genes to initiate the invasion process. However, the small sample sizes, lack of reliable in vitro culture methods and paucity of constantly expressed genes complicate the identification of new transcripts and regulatory motifs. In the future, single-cell profiling and long read sequencing of P. vivax isolates from geographically distinct regions should be combined with proteomic approaches to assess the full diversity of invasion-related ligand expression.

4.1. Primary attachment

The invasion process may be initiated by the reversible attachment of P. vivax merozoites to reticulocytes. This binding may be mediated by P. vivax Merozoite Surface Proteins (PvMSPs), which may form large complexes constituted of glycophosphatidylinositol anchored proteins and transmembrane proteins covering the surface of P. vivax merozoites. Based on the study of homologous PfMSPs in P. falciparum, it has been hypothesized that PvMSP1 may recognize a cogent receptor on the surface of reticulocytes. The C-terminal sub-unit (MSP-1₄₂) could be cleaved and most of the complex may be shed, leaving only a small C-terminal sub-unit (MSP-1₁₉) on the surface. Similarly, its paralog PvMSP1P may play an important role in the adhesion of P. vivax merozoites to reticulocytes through interaction with its C-terminal region [43]. Furthermore, it has been hypothesized that PvMSP7 may be a specific ligand for the receptor P-selectin which acts as a cell adhesion molecule [48] and that PvMSP1 and PvMSP7 could bind together to form a multi-protein complex that enhances invasion efficiency [47].

Other ligands may be involved in this step, but their ability to trigger attachment or abrogate recognition by the host immune system are unknown. For instance, the PvTRAg56.2 protein seems to co-localize with PvMSP1 on the merozoite surface and interact with PvMSP7 to play a stabilizing role [52]. In the same vein, the micronemal PvGAMA protein may bind to specific receptors on the surface of reticulocytes and thus play a role in the adhesion of P. vivax merozoites to their target host cells [65]. Indeed, the proteomic analysis of ankyrin 1 (ANK1) and Band 3 by various biochemical approaches, including liquid chromatography-mass spectrometry, showed that the fragment 2 of the membrane binding domain of ANK1 and the extracellular loop 5 of Band 3 bind to PfGAMA and PvGAMA. In addition, anti-Band 3-P5 antibodies block the binding of PfGAMA to erythrocytes [50]. Furthermore, field and laboratory studies showed that P. vivax exposure induce robust IgG responses to PvGAMA in natural exposure [84, 85] and that anti PvGAMA antibodies inhibit in vitro P. knowlesi invasion and growth [86], although knockout of the pkgama gene had a minimal effect on P. knowlesi growth. Thus, the primary attachment of P. vivax merozoites to reticulocytes or erythrocytes involves specific and reversible interactions to guarantee an efficient encounter.

4.2. Apical reorientation

Following primary attachment, P. vivax may undergo apical reorientation which triggers various ligand-receptor interactions. As P. vivax merozoites have a strong tropism for reticulocytes (0.2–2% of the total erythrocyte population), the chances to encounter a cell permissive to invasion are low. Thus, it was hypothesized that a host cell selection step occurs during apical reorientation to prevent the merozoites from invading non-target cells [87]. Based on the study of homologous proteins in other Plasmodium species, the PvRBP protein family is believed to mediate P. vivax tropism for reticulocytes. Previous works showed that native PvRBP1 and PvRBP2 may function as an adhesive protein complex [69] and PvRBP2a and PvRBP2b can bind reticulocytes independently of their Duffy phenotype [60]. In 2015, an ex vivo study confirmed that P. vivax merozoites preferentially target immature reticulocytes expressing the marker CD71 [61]. In 2018, another study showed that CD71 was the cogent receptor for the ligand PvRBP2b [88]. Analyses by cryo-electron microscopy, immunoprecipitation and fluorescence resonance energy transfer confirmed that the binding of PvRBP2b to CD71 is specific and directly proportional to the level of CD71 expression [89]. Finally, functional studies identified the marker CD98, expressed on the surface of immature reticulocytes, as the cogent receptor of PvRBP2a [62]. Both interactions PvRBP2b—CD71 and PvRBP2a—CD98 seem to drive the strict tropism of P. vivax for reticulocytes. Their action may be independent or combined, suggesting the potential existence of alternative invasion pathways. Apart from the PvRBP proteins, the P. vivax reticulocyte binding surface antigenic adhesin (PvRBSA) may also play a role in the recognition of reticulocytes. A recent study showed that the recombinant PvRBSA (rPvRBSA) binds specifically to Duffy-positive reticulocytes. But its cogent receptor is still unknown [63]. In addition to their adhesive function, PvMSP proteins may also help in the recognition of reticulocytes. Indeed, recent investigations showed that peptides from PvMSP1 have higher binding activity to reticulocytes than erythrocytes [45]. Although the mechanisms remain unclear, the recognition of immature reticulocytes by P. vivax merozoites seems to be governed by PvRBP2a and/or PvRBP2b, potentially in conjunction with PvRBSA and PvMSPs. The PvRBP proteins may also trigger subsequent steps of invasion such as the modulation of erythrocyte cytoskeleton, assembly of the tight junction or signalling for the secretion of rhoptry proteins.

4.2.1. Invasion

The apical reorientation is followed by the formation of a tight and irreversible junction between P. vivax merozoites and reticulocytes. Within Duffy-positive individuals, in absence of evidence, we do not know whether the P. vivax Duffy Binding Protein (PvDBP) localizes to the tight junction between merozoites surface and the receptor Duffy Antigen Receptor for Chemokines (DARC). Indeed, for P. falciparum, PfEBA175 (a P. falciparum erythrocyte-binding ligand) binds Glycophorin A to trigger release of PfRH5 and other rhoptry proteins, but PfEBA175 itself does not participate in junction formation. The PvDBP binding site is monomeric in the absence of DARC but dimerizes upon receptor engagement and forms a homodimer with the N-terminal extracellular domain of DARC [60]. The formation of the tight junction may also be facilitated by the secretion of the ligand P. vivax Apical Membrane Antigen 1 (PvAMA1) to the merozoite surface, the injection of P. vivax rhoptry neck protein (PvRON) complexes to the reticulocyte surface and their binding. Notably, it has been shown that PvRON5 has a marked binding preference for reticulocytes and is thus suspected to be involved in the invasion process [66]. Finally, the expression of various members of the P. vivax 6-cysteine protein (PvP) family on the merozoite surface is also thought to play a role in this step [64].

Within Duffy-negative individuals, the mechanisms and factors involved in the formation of the tight junction are unknown, but several hypotheses are currently discussed (Figure 3). In Madagascar, the evidence of vivax infections in Duffy-negative patients correlated with the existence of a common pvdbp gene duplication. This supported the hypothesis that the pvdbp gene amplification may enhance the binding of the PvDBP protein to another receptor with lower affinity. However, such an alternative receptor has not been identified yet. Further P. vivax strains presenting multiple pvdbp copies are frequently found in endemic zones where Duffy-negativity is rare [53]. A second hypothesis is that the PvEBP ligand may work as an alternate ligand for the invasion of Duffy-negative reticulocytes. Indeed, PvEBP appears to share structural similarities with PvDBP such as a Duffy binding site and a C-terminal domain with conserved cysteine positions, and likely similar functions [55]. Based on these structural similarities, a recombinant receptor binding site for PvEBP (rPvEBPII) was produced. Results of binding assays showed that PvEBPII binds preferentially immature Duffy-positive reticulocytes, but a minimal binding was observed in immature Duffy-negative reticulocytes. In contrast, no binding was observed for mature erythrocytes [57, 58]. Recently, a functional study performed on P. vivax isolates from Ethiopia confirmed that PvEBPII can bind both Duffy-positive and Duffy-negative reticulocytes though at a lower frequency than PvDBP. This finding indicate that PvEBPII may not have the same binding capacities as PvDBPII despite their structural similarities [51]. As the cogent receptor of PvEBP is still unknown, it is unclear whether this potential alternate ligand plays a role in the invasion of Duffy-negative reticulocytes. Finally, it was recently alleged that Duffy-negative reticulocytes may express low and/or transient levels of DARC on the surface of their reticulocytes. Preliminary data suggest that DARC may be expressed on the surface of erythroid precursor cells from Duffy-negative individuals but require to be confirmed [90].

4.3. Invagination

Once P. vivax merozoites are irreversibly committed to invasion, they can penetrate the reticulocytes via glideosome activity and seal themselves within the parasitophorous vacuole. Although these mechanisms remain unclear, it seems that PvTRAg36.6 and P. vivax early transcribed membrane protein (PvETRAMP) colocalize in the apical region of the merozoites to form and/or maintain the parasitophorous vacuole membrane [52].

While proteomic technologies are not yet fully exploited, they seem essential to answer long-standing questions about P. vivax invasion mechanisms. The constant improvement of techniques (two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry, yeast two-hybrids screens, etc.), high-throughput approach, computational prediction programs and data processing capabilities offers great promises to study the expression, interaction, and modification of P. vivax invasion-related ligands. However, proteomic data alone may be insufficient to establish a fine analysis of the invasion process and propose testable models. They require to be integrated into a more global and fundamental knowledge of P. vivax biology [91].

2.1. Le rôle crucial du gène pvdbp dans l’invasion des réticulocytes Duffy-positifs

Le gène P. vivax Duffy binding protein (pvdbp) code pour le ligand PvDBP [71]. Il présente des séquences de codage pour un domaine peptidique N-terminal, un domaine d’attachement Duffy riche en cystéines (PvDBPII), un autre domaine riche en cystéines (PvDBPVI), un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique C-terminale [72]. Sur la base des données actuelles de séquençage à haut débit, notre appréciation de la diversité génétique est de moins en moins limitée par la nature et/ou la densité des marqueurs génomiques étudiés. Notamment, la publication récente de plus de deux cents génomes de P. vivax a montré que les séquences du gène pvdbp étaient hautement polymorphes, quelle que soit leur origine géographique. Il est intéressant de noter que de nombreux polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) non synonymes ont été trouvés dans le domaine PvDBPII [53]. La diversité et la localisation de ces SNPs suggèrent que le gène pvdbp pourrait subir une pression sélective différentielle en raison des réponses des anticorps et de sa fonction dans la liaison aux récepteurs et l’invasion [51].

En outre, les variations du nombre de copies (CNV) au niveau du locus pvdbp se sont révélées être l’une des expansions génétiques les plus courantes, avec des allèles multiples [73]. Alors que la détection des CNVs reposait dans le passé, sur des techniques coûteuses et nécessitant une main-d’œuvre importante comme l’hybridation in situ, les progrès récents du séquençage à haut débit ont permis leur détection directe à partir des données de séquençage. Notamment, les approches de séquençage du génome entier ont révélé deux duplications distinctes chez les souches P. vivax circulant à Madagascar et au Cambodge. À Madagascar, les isolats de P. vivax provenant de patients Duffy-positifs et Duffy-négatifs présentaient une duplication commune avec deux copies de pvdbp l’une à côté de l’autre [74]. Au Cambodge, une duplication différente du gène pvdbp a été couramment détectée dans les isolats de P. vivax provenant de patients Duffy-positifs. De plus, la proportion d’isolats de P. vivax portant la duplication s’est avérée être significativement plus élevée chez les patients homozygotes Duffy-positifs que chez les patients hétérozygotes Duffy-positifs qui devraient présenter une plus faible expression de DARC à la surface de leurs réticulocytes. Cependant, cette dernière analyse n’a pas permis d’exclure complètement que les patients puissent être porteurs de plusieurs clones de P. vivax, alors que l’estimation des CNVs par PCR quantitative ne reflète que le clone principal [53]. Récemment, une étude géographique a démontré que les deux duplications distinctes du gène pvdbp circulaient en Asie, en Amérique du Sud et en Afrique de l’Est. Alors que la Duffy-négativité est prévalente dans certaines régions, les duplications du gène pvdbp ont également été largement trouvées dans des régions où la Duffy-négativité était presque absente [51]. En revanche, une analyse génomique simultanée a montré qu’aucune duplication de pvdbp n’a été trouvée dans cent quatre-vingt-deux isolats de P. vivax provenant de onze pays endémiques. Cependant, il a été remarqué que cette divergence était probablement due aux amorces utilisées pour la validation des CNVs par PCR [75].

Malgré la spécificité et la distribution des duplications du gène pvdbp, rien n’indique que les génomes de P. vivax aient contourné la barrière de la Duffy-négativité grâce à cette variation génétique. Des expansions plus importantes de pvdbp ont également été détectées dans le monde entier. Elles se regroupent séparément mais présentent des schémas similaires. Une grande diversité d’haplotypes a également été observée entre les copies, tandis que les séquences flanquantes 5′ et 3′ présentaient une diversité modérée [76]. Dans la région Asie-Pacifique, le séquençage de plus de deux cents isolats de P. vivax provenant de patients Duffy-positifs a révélé la présence commune de deux à trois copies du gène pvdbp [73]. En Ethiopie, les séquences de deux isolats de P. vivax provenant de patients Duffy-négatifs ont montré la présence de trois et huit copies du gène pvdbp [57]. Par la suite, une autre expansion commune du gène pvdbp, assez similaire à celles précédemment décrites à Madagascar et au Cambodge mais allant de trois à cinq copies, a également été détectée [51]. Ces résultats suggèrent que l’expansion du gène pvdbp pourrait permettre la survenue de mutations dans la deuxième copie du gène. De telles expansions pourraient faciliter la liaison à un autre récepteur érythrocytaire ayant une affinité plus faible pour le ligand PvDBP [57]. Cependant, il n’y a aucune preuve de l’existence de CNVs localisés et sélectionnés qui amélioreraient l’efficacité de l’invasion et induiraient une pression sélective. Étant donné que l’invasion des érythrocytes Duffy-positifs dépend de l’interaction entre PvDBP et DARC, il est probable que les expansions du gène pvdbp soient dues à des variations génétiques de DARC ou à des réponses à des anticorps inhibant l’attachement au domaine PvDBPII [75]. Néanmoins, il ne semble pas que ces expansions donnent au parasite une capacité accrue pour envahir les érythrocytes Duffy-négatifs.

2.2. Le potentiel rôle du gène pvebp dans une voie d’invasion alternative

Le gène P. vivax erythrocyte binding protein (pvebp) a été découvert grâce à l’assemblage de novo d’un isolat de P. vivax du Cambodge. Il code pour un ligand putatif de la protéine P. vivax Erythrocyte Binding Protein (PvEBP) et est présent dans la plupart des génomes de P. vivax. L’organisation du gène pvebp est similaire à celle du gène pvdbp avec un peptide signal N-terminal, un domaine d’attachement Duffy PvEBPII semblable au domaine PvDBPII, un autre domaine riche en cystéines PvEBPVI, un domaine transmembranaire et une queue cytoplasmique C-terminale [55]. Malgré ces similitudes, le gène pvebp semble se regrouper séparément de tous les gènes possédant un domaine d’attachement Duffy-binding like. Le séquençage de l’ADN de dix génomes de P. vivax provenant d’Asie, du Pacifique Sud, d’Afrique, d’Amérique centrale et d’Amérique du Sud a montré que le gène pvebp est polymorphe bien que moins divers que le gène pvdbp. En effet, le gène pvebp ne présente que 11 sites polymorphes sur 2412 positions alors que le gène pvdbp présente 32 sites polymorphes sur 3213 positions pour les mêmes échantillons. La plupart des SNPs détectés étaient non synonymes [55]. De plus, l’analyse génomique de deux cent dix-neuf isolats de P. vivax provenant de patients Duffy-positifs au Cambodge et à Madagascar a confirmé que le gène pvebp était moins diversifié que le gène pvdbp (12 vs. 33 allèles observés à partir des mêmes isolats) et ne présentait que des mutations non synonymes indiquant l’existence d’une forte pression sélective. En effet, onze mutations ponctuelles non synonymes ont été trouvées dans les séquences pvebp et ont conduit à douze allèles différents. Certains SNPs ont été observés dans les deux pays alors que d’autres étaient spécifiques au Cambodge et à Madagascar. Ces SNPs étaient distribués dans le domaine d’attachement [53]. Tout comme pour le gène pvdbp, la diversité et la distribution des SNPs dans le gène pvebp reflètent l’existence probable d’une pression sélective, bien qu’elle semble opérer à un niveau plus faible [58].

L’analyse génomique des isolats de P. vivax du Cambodge, de Madagascar et d’Éthiopie a également révélé l’existence de variations du nombre de copies dans le gène pvebp. À Madagascar, des expansions du gène pvebp ont été observées, allant de deux à cinq copies. Une distribution bimodale des parasites avec une population spécifique présentant plus de trois copies a été trouvée. Cependant, aucune différence significative de susceptibilité à l’infection à P. vivax n’a été observée entre les individus homozygotes et hétérozygotes Duffy-positifs. Au Cambodge, les expansions de pvebp variaient d’une à deux copies. La proportion d’isolats de P. vivax présentant des copies multiples du gène était plus importante dans les zones de forte transmission [53]. Dans l’ensemble, une proportion élevée d’isolats de P. vivax avec des copies de gènes multiples a été trouvée à Madagascar où la Duffy-négativité et la Duffy-positivité coexistent par rapport au Cambodge où la Duffy-négativité est pratiquement absente. En revanche, aucune expansion de pvebp n’a été trouvée en Éthiopie où la Duffy-négativité est également fréquente [51]. Compte tenu des similitudes observées entre les gènes pvdbp et pvebp, le polymorphisme et l’expansion du gène pvebp pourraient être corrélés à l’expression d’un nouveau ligand interagissant avec des protéines membranaires érythrocytaires autres que DARC et contribuer ainsi à une voie d’invasion alternative [55]. Cependant, aucune preuve que ces variations confèrent des capacités à infecter des individus Duffy-négatifs n’a été fournie jusqu’à présent.

2.3. Le rôle des gènes pvrbp et pvrbsa dans la sélectivité des réticulocytes

La famille de gènes P. vivax reticulocyte binding protein (pvrbp) a été identifiée sur la base de l’annotation des ligands adhésifs du génome de P. vivax [69]. Le séquençage du génome de plusieurs isolats de P. vivax a identifié onze membres de la famille pvrbp, dont cinq gènes complets (pvrbp1a, pvrbp1b, pvrbp2a, pvrbp2b et pvrbp2c), trois gènes partiels (pvrbp1p1, pvrbp2p1 et pvrbp2p2) et trois pseudogènes (pvrbp2d, pvrbp2e et pvrbp3) [77]. Les gènes pvrbp sont constitués de deux exons, l’un codant pour un peptide signal dans la région N-terminale et l’autre pour un domaine transmembranaire dans la région C-terminale [56]. Des études récentes ont montré que leur diversité génétique semble être généralement faible, sauf pour les gènes pvrbp2 [68]. L’analyse des isolats de P. vivax de Chine, de Thaïlande et d’Éthiopie a confirmé que le gène pvrbp2c était hautement polymorphe [51? , 59]. Bien que pvrbp2a et pvrbp2b présentent des régions hautement conservées, l’analyse génomique des isolats de P. vivax de Papouasie-Nouvelle-Guinée et de Thaïlande a montré qu’ils étaient également relativement polymorphes [59, 60]. Comme observé pour les gènes pvdbp et pvebp, les SNPs non synonymes se sont regroupés autour de trois sites principaux, dont le domaine de liaison aux réticulocytes. Cela peut refléter l’importance fonctionnelle de ce site de liaison et l’existence d’une pression sélective [60].

De plus, des CNVs affectant à la fois pvrbp2a et pvrbp2b ont été observés dans deux isolats de P. vivax de Thaïlande. Alors qu’une souche présentait une duplication des deux gènes (pvrbp2a et pvrbp2b), l’autre souche avait deux copies de pvrbp2b seulement [59]. Ces résultats suggèrent que les gènes pvrbp peuvent coder des ligands impliqués dans la reconnaissance de cellules cibles. Le gène P. vivax reticulocyte binding surface antigen (pvrbsa) a également été identifié comme un gène potentiellement impliqué dans la reconnaissance des réticulocytes, bien qu’il présente moins de diversité génétique que les autres gènes de surface des mérozoïtes de P. vivax [63].

2.4. Le rôle potentiel des gènes pvmsp dans l’attachement primaire

La famille de gènes P. vivax merozoite surface protein (pvmsp) code pour de multiples déterminants antigéniques qui sont suspectés être les médiateurs de l’attachement primaire entre les mérozoïtes de P. vivax et les réticulocytes humains [11]. Ces gènes pvmsp sont hautement polymorphes. En particulier, pvmsp1 [43], pvmsp3 [43, 78] et pvmsp7 [46] présentent de nombreux SNPs non synonymes indiquant qu’ils peuvent être soumis à une pression immunitaire sélective [51]. L’analyse des isolats de P. vivax d’Éthiopie a révélé que pvmsp3 présentait des CNVs allant d’une à quatre copies. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les expansions de pvdbp et pvmsp3 ont souvent été observées en tandem. La pertinence fonctionnelle de cette expansion du nombre de copies n’est pas encore connue.

2.5. Les autres gènes et leur rôle potentiel dans la voie d’invasion de P. vivax

D’autres gènes de P. vivax sont suspectés d’être impliqués dans le processus d’invasion. Par exemple, la famille des gènes P. vivax tryptophan rich antigen (pvtrag) coderait pour trente-six protéines qui peuvent se lier aux érythrocytes humains [79]. L’analyse génomique de souches de P. vivax en Éthiopie a révélé que la famille de gènes pvtrag ne semble porter que quelques polymorphismes génétiques [51]. De même, le gène P. vivax glycosylphosphatidylinositol-anchored micronemal antigen (pvgama) code pour l’antigène micronémique ancré dans le glycosylphosphatidylinositol de P. vivax (PvGAMA) qui se lie aux érythrocytes indépendamment du statut Duffy [43]. Cette protéine peut jouer un rôle dans l’adhésion des mérozoïtes de P. vivax à leurs cellules cibles [49]. Enfin, la famille de gènes P. vivax rhoptry neck protein (pvron) code pour les protéines P. vivax Rhoptry Neck (PvRON) qui pourraient participer à la formation de la jonction serrée comme cela a été démontré pour les homologues de P. falciparum [67].

Les technologies génomiques ont clairement contribué à affiner la recherche sur le paludisme à P. vivax en réduisant le coût du séquençage ainsi qu’en améliorant la qualité et la disponibilité des séquences. Cependant, seules quelques centaines de génomes de P. vivax ont été séquencés jusqu’à présent. Les isolats de terrain et cliniques présentent une faible parasitémie et une forte contamination par l’ADN humain, ce qui rend toujours difficile l’acquisition d’une quantité suffisante d’ADN parasitaire de bonne qualité. Pourtant, les séquences génomiques disponibles à ce jour ont permis l’identification de quelques gènes potentiellement liés à l’invasion. Les polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) et les variations du nombre de copies (CNVs) trouvés dans ces gènes peuvent conduire à des différences structurelles et entraîner des pressions sélectives. Cependant, les conséquences fonctionnelles de ces variations restent inconnues. L’analyse des génomes de P. vivax devrait être combinée à l’identification de leurs profils transcriptomiques et à la caractérisation de leurs protéines putatives afin de détecter des signatures spécifiques, susceptibles de fournir des informations sur leur fonction. Mais l’absence de méthodes robustes permettant de cultiver in vitroP. vivax rend l’analyse fonctionnelle difficile.

3.1. Expression spécifique des gènes liés à l’invasion

La génération de transcriptomes de haute qualité à travers l’utilisation de multiples isolats de P. vivax est essentielle pour explorer les changements dans l’expression des gènes tout au long du cycle intra-érythrocytaire. Récemment, les profils transcriptomiques d’isolats de P. vivax d’infections sanguines provenant de singes Aotus et Saimiri ont révélé que la plupart des gènes de P. vivax avaient une expression spécifique à un stade parasitaire et étaient fortement surexprimés, contrairement aux gènes domestiques [5]. Étant donné que la plupart des infections cliniques étaient asynchrones, l’analyse des transcriptomes de P. vivax a permis d’identifier des populations distinctes. Les anneaux et les trophozoïtes précoces exprimaient principalement des gènes impliqués dans la transcription et la traduction, tandis que les trophozoïtes tardifs et les schizontes exprimaient des gènes potentiellement liés à l’invasion [5]. Par exemple, les transcrits pvebp et pvrbp1 ont été trouvés fortement exprimés pendant le stade schizonte de P. vivax [? 56]. De même, les transcrits pvmsp3 ont été détectés dans les schizontes très tardifs [5] et le transcrit pvmsp7 a généralement atteint un pic pendant la transition trophozoïte tardif vers schizonte, lorsque les mérozoïtes sont formés [47]. Dans la souche de P. vivax adaptée au modèle primate (VCG-1), les transcrits pvron5 ont été trouvés dans les schizontes [66]. De plus, des expériences de séquençage ARN menées avec des isolats de P. vivax cultivés ex vivo provenant du Brésil ont montré une grande variation dans l’expression des gènes suspectés d’être impliqués dans l’interaction hôte-parasite, la sélectivité des réticulocytes ou l’invasion. En particulier, pvmsp1, pvmsp9, P. vivax merozoite surface antigen 180 (pvmsa180), P. vivax rhoptry-associated membrane antigen (pvrama) et P. vivax rhoptry H3 (pvrhoph3) étaient les plus exprimés parmi tous les gènes [44]. L’expression des gènes liés à l’invasion dans les schizontes tardifs implique l’importance du développement des mérozoïtes et de l’invasion des réticulocytes pour la survie de P. vivax.

3.2. Expression sélective des gènes liés à l’invasion de P. vivax

Le génome actuel de P. vivax contient de nombreuses familles de gènes qui ont été définies sur la base de l’homologie de séquence et de la conservation des domaines d’acides aminés. Les analyses de séquençage RNA à l’échelle de la cellule (single cell) ont démontré que l’expression sélective des gènes peut être due à leur rôle spécifique ou à des fonctions supplémentaires. Alors que la plupart des gènes pvmsp sont exprimés au cours des stades de développement tardifs, on a constaté que pvmsp3 était exclusivement exprimé dans les schizontes très tardifs, ce qui suggère son rôle dans le processus d’invasion. Étonnamment, un gène similaire à pvmsp7 s’est avéré être exprimé exclusivement dans les gamétocytes, ce qui implique une différence fonctionnelle [5]. Des résultats comparables ont été rapportés en utilisant des isolats cliniques de P. vivax provenant de Thaïlande. Alors que l’expression de la plupart des gènes pvmsp7 était associée aux schizontes, les gènes pvmsp7a et pvmsp7f ont maintenu des niveaux d’expression élevés pendant tout le cycle intra-érythrocytaire. Ces résultats suggèrent que ces paralogues peuvent avoir des fonctions supplémentaires en plus de leur rôle établi à la surface des mérozoïtes [47].

De même, des niveaux d’expression différents ont été observés parmi les membres de la famille de gènes pvtrag, mais leur signification est inconnue [5]. Malgré leur homologie de séquence, les membres d’une famille de gènes peuvent également avoir des fonctions différentes à des moments spécifiques [5]. Enfin, un séquençage du transcriptome sans amplification et directionnel (DAFT) de quatre isolats de P. vivax du Cambodge a révélé que la transcription peut être un processus sélectif dans lequel les parasites sélectionneraient des membres particuliers d’une famille de gènes en réponse à l’hôte [80]. Les auteurs ont montré que les gènes dont l’expression variait le plus entre les isolats étaient physiquement regroupés le long de régions chromosomiques. Par exemple, le locus pvmsp3 présente de nombreux paralogues qui étaient susceptibles d’être fonctionnellement redondants, augmentant ainsi la diversité antigénique et améliorant l’évasion immunitaire pendant le processus d’invasion. Au sein des clusters, l’expression des gènes semble se produire comme si les parasites choisissaient la version du gène à exprimer chez un hôte donné [80]. Globalement, ces résultats reflètent une régulation du développement et une différenciation fonctionnelle au sein de familles de gènes spécifiques.

3.3. Amplification des gènes liés à l’invasion de P. vivax

Chez les espèces de Plasmodium, l’amplification des gènes peut constituer un moyen simple d’augmenter le niveau d’expression des gènes et de modifier ainsi les phénotypes d’invasion. Des études génomiques antérieures ont démontré que certaines souches de P. vivax présentaient une amplification des gènes liés à l’invasion. Notamment, le gène pvdbp est très variable dans le nombre de copies du gène. Par exemple, le profil transcriptomique de schizontes d’isolats cambodgiens de P. vivax a révélé que l’amplification du gène pvdbp était associée à une augmentation de l’expression d’ARN messager (ARNm), ce qui suggère une augmentation potentielle du niveau de la protéine PvDBP [54]. Étant donné que la protéine PvDBP joue un rôle crucial dans l’invasion des réticulocytes Duffy-positifs, on a émis l’hypothèse que les parasites capables d’infecter les réticulocytes Duffy-négatifs ont pu être sélectionnés pour leur capacité à utiliser des copies multiples de pvdbp afin de se lier à un récepteur alternatif [69]. Cependant, des souches de P. vivax avec des copies multiples de pvdbp ont également été couramment détectées dans des régions où la Duffy-négativité est rare. Par ailleurs, même si le gène pvebp présente de nombreuses similitudes avec le gène pvdbp, rien ne prouve que son amplification entraîne une augmentation des niveaux d’ARNm et/ou de protéines [53]. Ainsi, les conséquences fonctionnelles de l’expansion des gènes liés à l’invasion sont incertaines et nécessitent des investigations supplémentaires avec un nombre élevé d’isolats de P. vivax.

3.4. Un système de régulation complexe et dynamique

Les données transcriptomiques des parasites suggèrent que P. vivax présente une cascade transcriptionnelle étroitement régulée pendant son cycle intra-érythrocytaire [81]. Des études ont montré que les gènes co-exprimés présentaient des motifs conservés et des sites potentiels pour des protéines de liaison régulatrices [82]. Par exemple, de longues régions transcrites non traduites (UTR) 5′ et 3′ ont été observées dans des gènes suspectés être impliqués dans l’invasion et la formation de la vacuole parasitophore [80]. De plus, les variations des 5′-UTRs semblent conduire à une sélection différentielle des sites de début de transcription (TSS) reflétant la variation du niveau d’expression des gènes [83]. La présence de promoteurs bidirectionnels pour réguler l’expression de paires de gènes adjacents a également été fréquemment observée. Enfin, les modifications post-transcriptionnelles telles que la structure de la chromatine, les transcrits non codants et l’épissage alternatif peuvent jouer un rôle important dans la régulation, mais les mécanismes restent encore mal compris. Notamment, la relation spatiale présumée entre les gènes qui sont exprimés de manière variable suggère que la structure et l’accès à la chromatine peuvent être importants pour la régulation des gènes [83]. Ainsi, P. vivax dispose d’un réseau de régulation insaisissable et complexe qui peut régir l’expression des gènes liés à l’invasion et permettre ainsi au parasite de se développer dans les réticulocytes humains infectés.

La transcriptomique fournit des informations précieuses sur la dynamique des gènes liés à l’invasion de P. vivax. Il est probable que les schizontes de P. vivax expriment sélectivement des gènes spécifiques pour initier le processus d’invasion. Cependant, la petite taille des échantillons, le manque de méthodes de culture in vitro fiables et la dynamique d’expression des gènes de ménage compliquent l’identification de nouveaux transcrits et de motifs régulateurs. À l’avenir, l’exploration des profils transcriptomiques à l’échelle cellulaire et le séquençage à longue lecture d’isolats de P. vivax provenant de régions géographiquement distinctes devraient être combinés à des approches protéomiques pour évaluer toute la diversité de l’expression des ligands liés à l’invasion.

4.1. Attachement primaire

Le processus d’invasion semble être initié par l’attachement réversible des mérozoïtes de P. vivax aux réticulocytes. Cette fixation peut être médiée par les protéines de surface des mérozoïtes de P. vivax (PvMSP), qui peuvent former de grands complexes constitués de protéines ancrées au glycophosphatidylinositol et de protéines transmembranaires couvrant la surface des mérozoïtes de P. vivax. Sur la base de l’étude des protéines de surface des mérozoïtes de P. falciparum (PfMSP) homologues aux PvMSPs de P. vivax, on a émis l’hypothèse que la protéine PvMSP1 pourrait reconnaître un récepteur à la surface des réticulocytes humains. La sous-unité C-terminale (MSP-142) de PvMSP1 pourrait être clivée et la plus grande partie du complexe pourrait être éliminée, laissant seulement une petite sous-unité C-terminale (MSP-119) à la surface. De même, son paralogue PvMSP1P pourrait jouer un rôle important dans l’adhésion des mérozoïtes de P. vivax aux réticulocytes par interaction avec sa région C-terminale [43]. De plus, on a émis l’hypothèse que la protéine PvMSP7 pourrait être un ligand spécifique au récepteur P-sélectine qui agit comme une molécule d’adhésion cellulaire [48]. De même, la protéine PvMSP1 et la protéine PvMSP7 pourraient se lier ensemble pour former un complexe afin d’augmenter l’efficacité de l’invasion [47].

D’autres ligands pourraient être impliqués dans cette étape, mais leur capacité à déclencher l’attachement ou à abroger la reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte est inconnue. Par exemple, la protéine PvTRAg56.2 semble se localiser avec la protéine PvMSP1 à la surface du mérozoïte et interagir avec la protéine PvMSP7 pour jouer un rôle stabilisateur [52]. De la même façon, la protéine micronémale PvGAMA pourrait se lier à des récepteurs spécifiques à la surface des réticulocytes et ainsi jouer un rôle dans l’adhésion des mérozoïtes de P. vivax à leurs cellules hôtes cibles [65]. En effet, l’analyse protéomique de la protéine ankyrine 1 (ANK1) et de la protéine Band 3 par diverses approches biochimiques incluant la chromatographie liquide-spectrométrie de masse, a montré que le fragment 2 du domaine de liaison à la membrane de l’ANK1 et la boucle extracellulaire 5 de Band 3 se lient à la protéine PfGAMA et à la protéine PvGAMA. En outre, les anticorps anti-Band 3-P5 bloquent la liaison PfGAMA aux érythrocytes [50]. Par ailleurs, des études sur le terrain et en laboratoire ont montré que l’exposition à P. vivax induit des réponses IgG robustes à PvGAMA dans le cadre d’une exposition naturelle [84, 85] et que les anticorps anti-PvGAMA inhibent l’invasion et la croissance in vitro de P. knowlesi [86], bien que le knock-out du gène pkgama ait un effet minime sur la croissance de P. knowlesi. Ainsi, l’attachement primaire des mérozoïtes de P. vivax aux réticulocytes ou aux érythrocytes implique des interactions spécifiques et réversibles permettant la réorientation apicale.

4.2. Réorientation apicale

Après la fixation primaire, il se pourrait que P. vivax subisse une réorientation apicale qui déclenche diverses interactions ligand-récepteur. Comme les mérozoïtes de P. vivax ont un fort tropisme pour les réticulocytes (qui représentent entre 0,2% et 2% de la population érythrocytaire totale), les chances de rencontrer une cellule permissive à l’invasion sont faibles. On a donc émis l’hypothèse qu’une étape de sélection de la cellule hôte se produisait pendant la réorientation apicale pour empêcher les mérozoïtes d’envahir des cellules non ciblées [87]. D’après l’étude de protéines homologues chez d’autres espèces de Plasmodium, on pense que la famille de protéines PvRBP est responsable du tropisme de P. vivax pour les réticulocytes. Des travaux récents ont montré que les protéines PvRBP1 et PvRBP2 natives peuvent fonctionner comme un complexe protéique adhésif [69] et que les protéines PvRBP2a et PvRBP2b peuvent se lier aux réticulocytes indépendamment de leur phénotype Duffy [60]. En 2015, une étude ex vivo a confirmé que les mérozoïtes de P. vivax ciblent préférentiellement les réticulocytes immatures exprimant le marqueur CD71 [61]. En 2018, une autre étude a montré que CD71 était le récepteur du ligand PvRBP2b [88]. Des analyses par microscopie cryo-électronique, immunoprécipitation et transfert d’énergie par résonance de fluorescence ont confirmé que la liaison de PvRBP2b à CD71 était spécifique et directement proportionnelle au niveau d’expression de CD71 [89]. Enfin, des études fonctionnelles ont identifié le marqueur CD98, exprimé à la surface des réticulocytes immatures, comme étant le principal récepteur du PvRBP2a [62]. Les deux interactions PvRBP2b - CD71 et PvRBP2a - CD98 semblent être à l’origine du tropisme strict de P. vivax pour les réticulocytes. Leur action pourrait être indépendante ou combinée, ce qui suggère l’existence potentielle de voies d’invasion alternatives. Outre les protéines PvRBP, l’adhésine antigénique de surface liant les réticulocytes de P. vivax (PvRBSA) pourrait également jouer un rôle dans la reconnaissance des réticulocytes. Une étude récente a montré que la protéine PvRBSA recombinante (rPvRBSA) se lie spécifiquement aux réticulocytes Duffy-positifs. Mais son récepteur est encore inconnu [63]. En plus de leur fonction adhésive, les protéines PvMSPs peuvent également contribuer à la reconnaissance des réticulocytes. En effet, des études récentes ont montré que les peptides de la protéine PvMSP1 ont une activité de liaison plus élevée avec les réticulocytes qu’avec les érythrocytes [45]. Bien que les mécanismes ne soient pas encore clairs, la reconnaissance des réticulocytes immatures par les mérozoïtes de P. vivax semble être gouvernée par PvRBP2a et/ou PvRBP2b, potentiellement en conjonction avec la protéine PvRBSA et les protéines PvMSPs. Les protéines PvRBPs pourraient également déclencher des étapes ultérieures de l’invasion, telles que la modulation du cytosquelette érythrocytaire, l’assemblage de la jonction serrée ou la signalisation de la sécrétion de protéines PvRhops.

4.3. Invasion

La réorientation apicale pourrait être suivie par la formation d’une jonction serrée et irréversible entre les mérozoïtes de P. vivax et les réticulocytes. Chez les individus Duffy-positifs, en l’absence de preuves, nous ne savons pas si la protéine PvDBP se localise à la jonction serrée entre la surface des mérozoïtes et le récepteur DARC. En effet, pour P. falciparum, PfEBA175 (un ligand de liaison aux érythrocytes de P. falciparum) se lie à la Glycophorine A pour déclencher la libération de PfRH5 et d’autres protéines PfRhops. Mais PfEBA175 lui-même ne participe pas à la formation de la jonction. Le site de liaison de PvDBP est monomérique en l’absence de DARC mais se dimérise lors de l’engagement du récepteur et forme un homodimère avec le domaine extracellulaire N-terminal de DARC [60]. La formation de la jonction serrée pourrait également être facilitée par la sécrétion du ligand P. vivax Apical Membrane Antigen 1 (PvAMA1) à la surface du mérozoïte, l’injection de complexes de la protéine PvRON à la surface des réticulocytes et leur interaction. Il a notamment été démontré que PvRON5 a une préférence marquée pour les réticulocytes et est donc soupçonné d’être impliqué dans le processus d’invasion [66]. Enfin, l’expression de divers membres de la famille de la protéine vivax 6-cystéine (PvP) à la surface du mérozoïte jouerait également un rôle dans cette étape [64].

Chez les individus Duffy-négatifs, les mécanismes et les facteurs impliqués dans la formation de la jonction serrée restent inconnus, mais plusieurs hypothèses sont actuellement discutées (Figure 3). À Madagascar, la mise en évidence d’infections à P. vivax chez des patients Duffy-négatifs a été corrélée à l’existence d’une duplication commune du gène pvdbp. Ceci a conforté l’hypothèse selon laquelle l’amplification du gène pvdbp pourrait favoriser la liaison de la protéine PvDBP à un autre récepteur de moindre affinité. Cependant, un tel récepteur alternatif n’a pas encore été identifié. De plus, les souches de P. vivax présentant de multiples copies de pvdbp sont fréquemment trouvées dans les zones endémiques où la Duffy-négativité est rare [53]. Une deuxième hypothèse est que le ligand PvEBP pourrait fonctionner comme un ligand alternatif pour l’invasion des réticulocytes Duffy-négatifs. En effet, le ligand PvEBP semble partager des similitudes structurelles avec le ligand PvDBP, comme un site d’attachement Duffy-binding like et un domaine C-terminal avec des positions de cystéine conservées, et probablement des fonctions similaires [55]. Sur la base de ces similarités structurelles, un site de liaison au récepteur recombinant pour PvEBP (rPvEBPII) a été produit. Les résultats des essais de liaison ont montré que PvEBPII se lie préférentiellement aux réticulocytes immatures Duffy-positifs, mais une liaison minimale a été observée dans les réticulocytes immatures Duffy-négatifs. En revanche, aucune liaison n’a été observée pour les érythrocytes matures [57, 58]. Récemment, une étude fonctionnelle réalisée sur des isolats de P. vivax provenant d’Éthiopie a confirmé que PvEBPII peut se lier aux réticulocytes Duffy-positifs et Duffy-négatifs, mais à une fréquence plus faible que PvDBP. Cette découverte indique que le domaine PvEBPII n’a peut-être pas les mêmes capacités de liaison que le domaine PvDBPII malgré leurs similitudes structurelles [51]. Le récepteur principal de PvEBP étant encore inconnu, on ne sait pas si ce ligand alternatif potentiel joue un rôle dans l’invasion des réticulocytes Duffy-négatifs. Enfin, il a été récemment évoqué que les réticulocytes Duffy-négatifs peuvent exprimer transitoirement des niveaux faibles de DARC à la surface de leurs réticulocytes. Des données préliminaires suggèrent que DARC pourrait être exprimé à la surface des cellules précurseurs érythroïdes des individus Duffy-négatifs, mais cela doit encore être confirmé [90].

4.4. Invagination

Une fois que les mérozoïtes de P. vivax sont engagés de manière irréversible dans le processus d’invasion, ils pourraient pénétrer dans les réticulocytes via l’activité du glidéosome et se sceller dans la vacuole parasitophore. Bien que ces mécanismes ne soient pas clairs, il semble que la protéine PvTRAg36.6 et la protéine P. vivax Early Transcribed Membrane Protein (PvETRAMP) soient colocalisés dans la région apicale des mérozoïtes pour former et/ou maintenir la membrane de la vacuole parasitophore [52].

Bien que les technologies protéomiques ne soient pas encore pleinement exploitées, elles semblent essentielles pour répondre à des questions concernant les mécanismes d’invasion de P. vivax. L’amélioration constante des techniques (électrophorèse sur gel bidimensionnelle, spectrométrie de masse, criblage à deux hybrides de levure, etc.), l’approche à haut débit, les programmes de prédiction computationnelle et les capacités de traitement des données offrent d’énormes possibilités pour étudier l’expression, l’interaction et la modification des ligands de P. vivax. Cependant, les données protéomiques seules semblent être insuffisantes pour établir une analyse fine du processus d’invasion et proposer des modèles testables. Elles doivent être intégrées dans une connaissance plus globale et fondamentale de la biologie de P. vivax [91].