2.1 Synthèse peptidique

Le peptide amphip8 de 38 acides aminés a été synthétisé sur une résine Fmoc-PAL-PEG-PS (Applied Biosystems, France) avec un synthétiseur Pioneer^™ en flux continu. Le produit final, analysé en HPLC sur phase-inverse, présente un pic majeur représentant environ 65% du matériel total élué (données non montrées). Les quatre cystéines du peptide amphip8 ont été protégées avec le même groupement protecteur, le trityl. Le peptide est déprotégé et coupé de la résine avec le réactif K (82,5% TFA, 5% phénol, 5% thioanosole, 5% H₂O, 2,5% éthanedithiol) pendant environ 4 h. L'oxydation du peptide est réalisée à température ambiante dans un tampon Hepes (5 mM) à pH 8,5 pendant 2 j sous agitation à l'air libre.

La pureté et l'identité du peptide purifié ont été vérifiées par HPLC analytique et par spectrométrie de masse en electrospray (masse déterminée : 4160,02 Da, masse théorique : 4158,85 Da). Le peptide oxydé a été obtenu avec un rendement de 30,4%.

2.2 Mesures RMN

Toutes les expériences RMN, i.e., DQF-COSY, z-TOCSY et NOESY ont été enregistrées à différentes températures (15 °C, 25 °C, 35 °C et 45 °C) sur un spectromètre Bruker AMX 600 équipé d'une sonde triple résonance (¹H–¹³C–¹⁵N) avec gradient-z. La concentration de tous les échantillons était de 2 mM dans H₂O (5% de D₂O pour le lock) ou dans D₂O à pH 5,6.

3.1 Conception et synthèse

Les faisceaux d'hélices sont largement impliqués dans la fonction d'un grand nombre de protéines. Le motif minimal structural α₂p8 permet d'entrevoir la construction d'une petite protéine amphiphile (amphip8), qui possèderait, sur un côté, une surface hydrophile et chargée et, sur l'autre, une surface hydrophobe apte à interagir avec des faisceaux d'hélices de protéines de taille plus importante. L'analyse de la structure du peptide α₂p8 (code de la Protein Data Bank : 1ei0) suggère la possibilité d'introduire quelques mutations susceptibles de modifier la lipophilie du peptide, sans en dégrader le motif structural.

Il est important de rappeler que la séquence primaire d'α₂p8 provient en grande partie de la séquence correspondant aux deux premières hélices de la protéine humaine p8^MTCP1 [1]. Pour p8^MTCP1, une troisième hélice vient, par son extrémité NH₂ terminale, compléter le cœur hydrophobe de la protéine. De ce fait, α₂p8 possède déjà des acides aminés hydrophobes exposés au solvant, tels que : Ala⁷, Leu¹⁴, Ile²⁸ et Ala³⁵. Afin d'étendre cette surface hydrophobe pour notre nouveau peptide amphip8, les résidus Gln¹¹, Glu²¹ et Lys³² ont été remplacés par des alanines.

Sur la face opposée, déjà riche en acides aminés chargés (Lys⁵, Glu⁹ et Lys¹² pour l'hélice I ; Glu³⁰ et Lys³³ pour l'hélice II) l'Ala²⁶ a été remplacée par une lysine. Ce choix a été motivé tout d'abord par l'objectif de remplacer un résidu hydrophobe par un résidu chargé, mais aussi par celui de tenter de créer un pont salin avec la chaîne latérale du Glu³⁰ et stabiliser ainsi l'hélice II.

L'Ala⁸, correspondant à une cystéine orpheline dans la séquence de p8^MTCP1, est très exposée au solvant. Elle se trouve au milieu de l'hélice I, sur la face opposée à l'espace inter-hélice. Bien qu'elle n'altère pas la géométrie structurale de la protéine native [2], cette alanine est remplacée pour amphip8 par une glutamine plus hydrophile. En revanche, l'Ala³⁶, qui est sur la face exposée au solvant de l'hélice II, a été conservée.

Finalement, la Leu²⁰, située dans la boucle entre les deux hélices, a été remplacée par une glycine. Cette mutation devrait améliorer la flexibilité de la charnière entre les deux hélices et favoriser la structuration du peptide lors de la formation des deux ponts disulfure par oxydation ménagée des quatre cystéines (voir § Matériels et méthodes).

3.2 Caractérisation conformationnelle

Nous avons débuté une étude structurale du peptide amphip8 par RMN du proton à 600 MHz. Le peptide réduit, sans pont disulfure, présente un spectre RMN caractéristique d'un peptide qui n'est pas replié, avec un « entassement » des résonances de protons amides (H_N) sur une largeur spectrale inférieure à 1 ppm, ainsi qu'une très faible dispersion des protons alpha (Hα) et des protons des groupements méthyle (Fig. 2a). En revanche, le spectre RMN du peptide oxydé est plus éclaté, traduisant une structuration du peptide (Fig. 2b). La présence d'un nombre important de pics de corrélations NOESY dans la zone des protons amide (spectre non montré) traduit la présence d'une structuration secondaire en hélice. Nous avons donc poursuivi l'étude RMN sur le peptide oxydé.

L'attribution séquentielle des résonances des protons a été réalisée selon la méthode classique de Wüthrich [5]. La procédure implique : (1) l'identification des systèmes de spins des acides aminés sur la base des spectres 2D-TOCSYet (2) la connectivité de ces systèmes de spins selon la séquence en utilisant les pics de corrélations séquentiels d_αN et d_NN des spectres 2D-NOESY. Cette étape d'attribution des résonances des protons du squelette peptidique a été facilitée par la faible différence générale observée entre les déplacements chimiques des protons des acides aminés correspondants de α₂p8 et d'amphip8.

Cependant, des différences significatives apparaissent pour plusieurs acides aminés quand on compare leurs déplacements chimiques avec ceux du peptide α₂p8 (Fig. 3). Au niveau des H_N, certains acides aminés mutés (20, 21, 26 et 32) subissent des variations importantes, alors que les positions 8 et 11 ne semblent pas être touchées. Mais on note surtout des changements importants pour des résidus hydrophobes (Ile¹⁰, Leu¹⁴, Leu³¹ et Ala³⁵) qui sont disposés sur la même surface dans la structure modèle du peptide α₂p8. Le H_N de la Ser¹⁸ est aussi déplacé, ainsi que ceux des Gln²⁵ et Gln²⁹ qui se trouvent sur la face externe de l'hélice II. En ce qui concerne les Hα, des acides aminés mutés, surtout les positions 8, 20 et 26, subissent des déplacements importants. Mais également d'autres acides aminés présentent des variations plus importantes, comme l'Ile¹⁰, la Ser²², la Cys²⁴, l'Ile²⁸ et l'Ala³⁵.