2.1 Mesures de diffusion

Les expériences de diffusion ont été réalisées à l'aide d'une séquence d'impulsion LED [5] modifiée, utilisant des gradients bipolaires [6,7] pour prévenir les effets parasites dus aux courants de Foucault. Le signal résiduel d'HDO était supprimé par une irradiation à faible puissance pendant le délai de relaxation (1 s) et le délai de diffusion (400 ms). Pour déterminer le coefficient d'autodiffusion d'AKT2–PHD, 90 expériences 1D ont été enregistrées avec des délais de diffusion identiques et des impulsions de gradient de champ d'une durée de 2,4 ms et d'intensité variant entre 2 G cm^–1 et 47,5 G cm^–1 (4 à 95% de la puissance maximale de l'amplificateur de 10 A). Chaque expérience provenait de l'accumulation de 544 balayages (4 K points complexes). Le coefficient de diffusion d'AKT2–PHD a été obtenu à partir du déclin de l'intensité des pics en fonction de l'intensité des gradients par un traitement de type « maximum d'entropie » (MaxEnt) [8], avec une transformée de Laplace inverse calculée sur 128 points. Le poids moléculaire correspondant a été déduit, sans tenir compte d'aucun facteur de forme, d'une courbe d'étalonnage établie sous les mêmes conditions expérimentales à partir de protéines de poids moléculaire connu (ubiquitine : 8,5 kDa ; lysozyme : 14 kDa ; myoglobine : 16,9 kDa ; inhibiteur trypsique de soja : 24 kDa ; ovalbumine : 42,9 kDa).

2.2 Mesures de relaxation

Quand la relaxation d'un noyau ¹⁵N dépend essentiellement de l'interaction dipolaire avec un proton directement lié et de l'anisotropie de son déplacement chimique, les données de relaxation peuvent être interprétées en termes de mouvement du vecteur ¹⁵N–¹H [9]. Sachant que les trois paramètres de relaxation mesurés expérimentalement (R_N(N_z), R_N(N_xy) et NOE) dépendent des valeurs des fonctions de densité spectrale à cinq fréquences différentes [10,11], le calcul des densités spectrales peut être approché par l'approximation des hautes fréquences permettant un échantillonnage « réduit », grâce auquel les vitesses de relaxation sont directement traduites en densités spectrales à trois fréquences [12–15] par la relation :

dans laquelle $d^2={\left(\frac{{\mu }_0}{4\pi }\right)}^2\frac{h^2{\gamma }_N^2{\gamma }_H^2}{4{\pi }^2{r}_{\mathrm{NH}}^6}$ et $c^2=\frac{1}{3}{\left({\gamma }_N{B}_0\right)}^2{\left(\Delta \sigma \right)}^2$

où μ₀ est la perméabilité du vide, h la constante de Planck, γ_H (2,6752 × 10⁸ rad s^–1 T^–1) et γ_N (–2,711 × 10⁷ rad s^–1 T^–1) les rapports gyromagnétiques des noyaux ¹H et ¹⁵N, ω_H et ω_N les fréquences de Larmor ¹H et ¹⁵N, r_NH la distance internucléaire ¹⁵N–¹H (1,02 Å), B₀ l'intensité du champ magnétique et Δσ la différence entre les composantes parallèles et perpendiculaires du tenseur de déplacement chimique ¹⁵N de symétrie axiale (–170 ppm [16]). La vitesse de corrélation croisée R_N(H_z → N_z) entre l'¹⁵N et le proton amide est corrélée au NOE et calculée par la relation : NOE = 1 + (γ_H/γ_N) R_N(H_z → N_z)/R_N(N_z). La fréquence de la densité spectrale moyenne, <J(ω_H)>, a été prise égale à 0,87 ω_H [12].

Les séquences d'impulsions utilisées pour déterminer les valeurs des vitesses de relaxation ¹⁵N R_N(N_z) (R₁), R_N(N_xy) (R₂), et de ¹⁵N{¹H}NOE sont similaires à celles déjà décrites [10,11], et les paramètres expérimentaux utilisés ainsi que le traitement des données ont déjà été reportés en détail pour d'autres protéines étudiées au laboratoire [17,18]. La vitesse de relaxation longitudinale ¹⁵N (R_N(N_z)) a été obtenue à partir de 10 expériences d'inversion–récupération, avec des délais de relaxation allant de 18 à 1026 ms. La vitesse de relaxation transverse ¹⁵N (R_N(N_xy)) a été obtenue à partir de 10 expériences CPMG, avec des délais de relaxation allant de 16 à 144 ms. La valeur du NOE hétéronucléaire, ¹⁵N{¹H}, a été déterminée à partir du rapport de deux expériences réalisées avec et sans présaturation des protons.

3.1 Expériences de diffusion

Dans le cas d'une solution idéale et à dilution infinie, le coefficient de diffusion translationnel d'une molécule est donné par la relation de Stokes–Einstein :

Il est néanmoins possible, à partir du coefficient de diffusion, d'obtenir une information relative sur la masse d'une protéine via une courbe d'étalonnage construite à partir de mesures réalisées dans des conditions expérimentales strictement identiques sur des protéines de masse moléculaire connue. Pour des protéines sphériques et de même « compacité » (densité moyenne identique), D peut être exprimé selon :

3.2 Relaxation ¹⁵N

Les paramètres de relaxation ont pu être mesurés précisément pour 71 résidus d'AKT2–PHD (111 résidus, dont sept prolines et 18 résidus non attribués) et les densités spectrales correspondantes calculées en utilisant l'équation (1) (Fig. 3). Les faibles valeurs de J(0) obtenues pour les résidus N- et C-terminaux, ainsi que pour les segments peptidiques Gly¹⁶–Thr²¹ et Arg⁴¹–Leu⁵², indiquent une flexibilité accrue. Ces deux segments correspondent aux boucles variables VL1 et VL2. Dans ces régions, les faibles valeurs de J(0) sont compensées par des valeurs élevées de <J(ω_H)>, en bon accord avec l'hypothèse de la conservation de l'énergie du système. Les faibles valeurs de <J(ω_H)> obtenues pour le reste de la protéine indiquent une flexibilité restreinte sur une échelle de temps rapide. À 50 MHz, les valeurs de J(ω) montrent un profil inverse de celui observé pour celles de J(0) : des valeurs légèrement plus élevées sont observées pour les vecteurs NH localisés dans les boucles VL1 et VL2. Ceci démontre que J(ω_N) est légèrement supérieur à la fréquence isobestique, fréquence pour laquelle les contributions à J(ω) sont indépendantes de la mobilité interne. Les valeurs de J(0) mesurées pour les résidus Thr⁷² et Val⁵⁷ sont significativement plus élevées que la moyenne, sans pour autant être compensées par des valeurs plus faibles de J(ω_N) et <J(ω_H)>. Ceci indique la présence de mouvements plus lents que le temps de corrélation de la protéine, sur une échelle de temps comprise entre la micro- et la milliseconde. Ces contributions adiabatiques s'observent fréquemment autour des résidus aromatiques (Phe⁷³ et Phe⁵⁵) ou près d'un pont disulfure (Cys⁶⁰–Cys⁷⁷) : le déplacement des cycles aromatiques ou l'isomérisation des ponts disulfure entraînent des variations importantes de déplacement chimique, qui vont constituer des chemins de relaxation efficaces et contribuer ainsi à la relaxation transverse (terme R₂^ex), majoritairement représentée dans la valeur de la fonction de densité spectrale à fréquence nulle. Un mécanisme similaire peut être invoqué pour expliquer la dispersion des valeurs de J(0) observées dans l'hélice C-terminale.

En analysant les données de relaxation obtenues pour différentes protéines, Lefèvre et al. [15] ont montré qu'il existait souvent une corrélation linéaire entre J(0) et J(ω_N) :

Les données obtenues montrent que cette relation se vérifie pour AKT2–PHD (Fig. 4A). Si l'on considère que les mouvements mis en jeu dans une protéine sont limités par des mouvements purement diffusifs (Brownien) [15,19], un modèle lorentzien peut être utilisé pour décrire les densités spectrales :

La courbe théorique correspondant à ce modèle est reportée sur la Fig. 4A. Si l'on combine (2) et (3), on obtient une équation du troisième degré en τ_c:

On notera que certains points (cercles pleins : non pris en compte pour la régression linéaire) se trouvent hors ou très près de la courbe théorique : ils correspondent à des vecteurs – déjà signalés plus haut – animés de mouvements complexes (échange conformationnel...) dans un domaine de temps supérieur (μs–ms) au simple mouvement brownien (ns) de la protéine en solution. Les racines de l'équation (4) sont les temps de corrélation représentatifs des mouvements animant les vecteurs NH. Les coefficients α_N et β_N pouvant êtres déduits de la régression linéaire, cette équation se résout alors simplement. Une de ces racines est négative (–601 ns) et ne sera pas considérée, car elle n'a pas de sens physique. Les deux autres racines positives correspondent au temps de corrélation rotationnel de la protéine (τ_c = 13,81 ns) et à un temps de corrélation interne globale appelé τ_i [15,20] (τ_i = 0,70 ns). Ce temps de corrélation τ_i ne doit pas être considéré comme un paramètre physique. Il indique simplement l'existence d'une contribution de mouvements internes complexes au mouvement de chaque vecteur NH, sur une échelle de temps moyenne proche de la valeur de τ_i.

Il existe une relation empirique entre la valeur du temps de corrélation et le nombre de résidus de la protéine, établie à travers de nombreuses études de relaxation réalisées sur différentes protéines, de tailles diverses. Cette relation montre une corrélation linéaire entre le temps de corrélation et le nombre de résidus de la protéine (Fig. 4B). D'après cette relation et le temps de corrélation rotationnel précédemment déterminé, on peut déduire que le nombre de résidus d'AKT2–PHD est d'environ 117 résidus, ce qui est très proche de la taille du monomère (113 résidus).